標準PCRプロトコル

PCR法の進め方

標準的なポリメラーゼ連鎖反応（PCR）セットアップは、以下の4ステップで構成されます：

1. 必要な試薬またはマスターミックスとテンプレートをPCRチューブに添加します。
2. 混合し、遠心分離（スピンダウン）します。
   *サーマルサイクラーに加熱式の蓋がない場合は、蒸発しないようにミネラルオイルを添加してください。
3. サーマルサイクラーとプライマーのパラメータに従って増幅させます。
4. 増幅させたDNAを、アガロースゲル電気泳動と後続のエチジウムブロマイド染色によって評価します。

これらのステップのさらに詳しい説明と、関連製品および試薬選択のヒントについては後述します。ここに記載したのは、Taq DNAポリメラーゼを用いた基本的なPCRプロトコルです。

他のポリメラーゼのための追加プロトコルや高度なPCR技術については、PCR技術ガイドのプロトコルセクションをご覧ください。

標準PCRに関する詳しい説明については、PCRの基礎ページをご参照ください。

試薬：PCRに必要な製品は?

PCRに使用する試薬	推奨製品
Taq DNAポリメラーゼ	目的に応じたTaq DNAポリメラーゼを選択してください（後述するTaq ポリメラーゼ一覧を参照）
PCRグレードの純水	PCR用純水
実用濃度まで希釈したプライマー	ほとんどのアッセイには10 µM程度のワーキングストックで十分です
オリゴ	カスタムオリゴ
増幅されるDNA	研究者が準備
専用ピペット
サーマルサイクラー	さまざまなウェルブロックサイズやマルチフォーマットに対応
滅菌済みフィルターピペットチップ
滅菌済み1.5 mLねじ蓋式微量遠心チューブ	Corning®ねじ蓋式微量遠心チューブ（日本国内取扱いなし）
PCRチューブまたはプレート	サイクラーに合わせて選択：
	個別の肉薄200 µL PCRチューブ
	200 µLストリップチューブ
	マルチウェルプレートおよびプレートシール
dNTP混合液	dATP、dCTP、dGTP、およびdTTPを10 mMずつ含むデオキシヌクレオチド混合液 * readymixes にはdNTPがすでに含まれています

Taqポリメラーゼとは?

Taq DNAポリメラーゼは、好熱性細菌のThermus aquaticus由来の熱安定酵素です。PCRでDNAフラグメントを増幅するために一般的に使用されています。  この酵素はE. coliで発現させた組み換え体です。95℃までの反復加熱に活性を失うことなく耐性を示します（PCR技術の要件に適合）。この酵素のSDS-PAGEによる分子量は約94 kDaで、検出可能なレベルのエンドヌクレアーゼおよびエクソヌクレアーゼ活性はなく、5'→3' DNAポリメラーゼ活性および5'→3'エクソヌクレアーゼ活性を有します。Taq DNAポリメラーゼの各ロットには、PCR増幅と二本鎖シーケンシングの試験が行われます。この酵素は、5 units/µLで供給され、最適化された10×反応バッファーとともに提供されます。

標準Taq DNAポリメラーゼ

下表を用いて、お客様の反応条件に適したTaq DNAポリメラーゼの混合液を選択してください。染色処方を、透明または赤色、塩化マグネシウム（MgCl₂）を含むまたは含まない、事前調製のreadymixまたはバッファーとdNTPを含むマスターミックスから選択してください。

MgCl2を含む		MgCl2は別	Readymix
色素なしの透明処方	ゲルに直接ロードするための赤色色素	色素なしの透明処方	ゲルに直接ロードするための赤色色素	色素なしの透明処方
Thermus aquaticus由来のTaq DNAポリメラーゼ（D1806）	REDTaq® DNAポリメラーゼ （D4309）	Thermus aquaticus由来のTaq DNAポリメラーゼ、MgCl2なし（D4545）	REDTaq® ReadyMix™ PCR Reaction Mix （R2523）	ReadyMix™ Taq PCR Reaction Mix （P4600）

ユニットの定義：1つのユニットは、74℃、30分で10 nmolの総デオキシリボヌクレオシド三リン酸を酸沈殿性DNAに組み込みます。

手順：PCRのステップ

Taq DNAポリメラーゼ、テンプレートDNA、プライマーおよびMgCl₂の最適濃度条件は、利用するシステムによって異なります。そのため、個々の構成要素に合わせて最適条件を決める必要があります。このことは、特にTaq DNAポリメラーゼ、サイクルパラメータ、およびMgCl₂濃度についてあてはまります。最適効率を定めるには、酵素とMgCl₂を滴定することをお勧めします。

1. 表に記載されている順番で、試薬を適切なサイズのチューブに添加します。（標準試薬またはreadymix試薬の反応セットアップに該当する表を選択してください）反応数が多い場合は、テンプレートを含まないマスターミックスをセットアップして反応チューブに分注し、最後にテンプレートを該当するチューブに添加してください。
   

標準PCR反応

容量	構成要素	最終濃度
w µL	水
5 µL	10×PCRバッファー（P2192またはP2317）*	1×
1 µL	デオキシヌクレオチド混合液	200 µM
w µL	フォワードプライマー （通常の長さは15～30塩基）	0.1～0.5 µM
x µL	リバースプライマー （通常の長さは15～30塩基）	0.1～0.5 µM
0.5 µL	Taq DNAポリメラーゼ*	0.05 units/µL
y µL	テンプレートDNA（通常は10 ng）	200 pg/µL
z µL	25 mM MgCl2（バッファーP2317のみと併用）	0.1～0.5 mM
50 µL	総反応容量

*バッファーとTaq ポリメラーゼを一緒に購入してください：D1806、D4309またはD4545

ReadyMix™ PCR Reaction

容量	構成要素	最終濃度
25 µL	ReadyMix™（R2523またはP4600）
w µL	フォワードプライマー （通常の長さは15～30塩基）	0.1～0.5 µM
x µL	リバースプライマー （通常の長さは15～30塩基）	0.1～0.5 µM
y µL	テンプレートDNA（通常は10 ng）	200 pg/µL
z µL	水
50 µL	総反応容量

2.ゆっくり撹拌し混合してから軽く遠心し、すべての構成要素をチューブの底に集めます。

注記：加熱式の蓋がないサーマルサイクラーを使用する場合は、蒸発しないように各チューブの上部にミネラルオイルを50 µL添加してください。

3.増幅させます。増幅パラメータは、使用するプライマーとサーマルサイクラーによって異なります。個々のプライマー、テンプレート、およびサーマルサイクラーに合わせてシステムを最適化する必要があります。

一般的なサイクルパラメータ

25～30サイクルの増幅が推奨されます。

PCRステップ	温度 ℃	持続時間
テンプレートの変性	94℃	1分
プライマーのアニーリング	55℃	2分
伸長	72℃	3分

4.増幅させたDNAは、アガロースゲル電気泳動と後続のエチジウムブロマイド染色によって評価できます。

      注記：1回のクロロホルム抽出（1：1）によってミネラルオイルのカバーが除去されて、水溶液相に戻る場合があります。

核酸電気泳動用試薬

• アガロース（プレキャストゲル、粉末など）
• MOPS‐EDTA‐酢酸ナトリウム、トリス‐酢酸‐EDTA（TAE）またはトリス‐ホウ酸塩‐EDTA（TBE）などのバッファー
• RNA用のゲルローディング溶液とサンプルローディングバッファー
• エチジウムブロマイドなどの電気泳動染料または色素

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ラベルライセンス宣言

ご購入の際の注意点：ライセンスの排除

米国特許番号5,804,375、5,994,056、6,171,785、6,214,979、5,538,848、5,723,591、5,876,930、6,030,787、6,258,569、および対応する米国以外の特許のいずれか、あるいは5’‐ヌクレアーゼおよびdsDNA‐結合染色プロセスに関連するその他の特許または特許出願の対象となる本製品の購入により譲渡されるライセンスはありません。詳細については、Applied Biosystemsライセンス担当（850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, USA）までお問い合わせください。