Expand™ Long Template PCR Systemプロトコルのトラブルシューティング

Expand™ Long Template PCR System（製品番号ELONG-RO）は、プルーフリーディング活性を有する熱安定性Taq DNAポリメラーゼおよび熱安定性DNAポリメラーゼの酵素混合物です。このポリメラーゼ混合物は、ゲノムDNAから高い収率でPCR産物を生成します。Expand™ Long Template PCR Systemは、ヒトゲノムDNAから最高20 kb、λDNAから最高40 kbのDNAフラグメントの増幅を可能にします。

DNA増幅プロトコルのトラブルシューティング

ミトコンドリアDNAの増幅
Expand Long Template PCR Systemを用いたミトコンドリアDNAの増幅は、以下の文献をご参照ください。

• Paul et al., Rapid mapping of mitochondrial DNA deletions by large-fragment PCR, Trends in Genetics Vol 12, p131, 1996
• Ray et al., The spectrum of mitochondrial DNA deletions is a ubiquitous marker of ultraviolet radiation exposure in human skin.J. Invest. Dermat., Vol 115, p 647, 2000

バッファー類
すべてのExpand™ Long Template PCR Systemバッファー類は常に使用前に解凍し37～56℃で平衡化してください。さらに、バッファー類は十分にボルテックスしてください。結晶が析出した場合、37～56℃でインキュベートし溶解してください。このステップの後はバッファーを氷上に静置しないでください。最後の反応物をピペットで注入した後、直ちに反応を開始してください。完了した反応混合液を氷上で保存しないでください。

Thermal Block Cycler
添付文書で推奨されている温度プロファイルはApplied Biosystems GeneAmp PCR System 9600のために開発されました。他のサーマルブロックサイクラーでは、わずかに異なるプロファイルが必要となる可能性があります。一般的にロングレンジPCRは、異なるサーマルブロックサイクラーのランピングまたは熱伝導率の微小な差に敏感です。このため、Expand™ Long Template PCRの実験は常に同一のサーマルブロックサイクラーで実施してください。もし別のサーマルブロックサイクラーに替える場合は、反応条件および温度プロファイルを調整してください。最適なアニーリング温度は、プライマーの融解温度および使用するシステムによって変動します。伸長時間は、フラグメントの長さによって変動します。15 kbフラグメントでは、11分間の伸長時間を推奨します。

ゲル電気泳動PCR産物のスメア
ゲル電気泳動後のPCR産物がスメアになる場合は以下を推奨します。

• PCRサイクル数を減らす
• テンプレート濃度を下げる
• 反応に使用する酵素量を減らす
• 過去のPCRで良好な結果を示したコントロールテンプレートの増幅によりPCRプライマーの性能を確認
• 1種類のバッファーですでにアッセイを確立済みの場合でも、3種類の反応バッファーすべてについて検査する：バッファー1‐0.5～9 kb、バッファー2‐9～12 kb、バッファー3‐12 kb超
• 一部のケースでは、伸長温度を66℃に低下させることにより結果が改善することがある

利用できる第2世代製品
ロングレンジPCRの課題に対応するため、第2世代キットExpand™ Long Range dNTPackを開発しました。本キットには同一の酵素ミックスが含まれていますが、さらに柔軟性を高めています。Expand Long Range dNTPackには、2つのユニバーサルバッファー（MgCl₂含有バッファー1つ、MgCl₂非含有バッファー1つ）が含まれています。MgCl₂ストック液およびDMSOは別々の試薬の形で含まれています。最良の結果を得るためには、対応する添付文書に示された最適化ガイドラインに従ってください。