First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-PCR（AMV）を使用したRNAの取り扱い方

First Strand cDNA Synthesis Kit（製品番号11483188001）は、2ステップRT-PCRの開始反応として first strand cDNAの合成に使用されます。このキットには、逆転写酵素AMV、2つの異なるプライマー、PCRヌクレオチドミックス、コントロールNeo pa RNAが含まれています。RT-PCRにより生成されたPCR産物は、標準的な手順を用いてクローニングすることができます。

RNAの増幅には、RNA基質のDNAへの変換が必要です。これは、逆転写酵素AMV RT（トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素）を使用して行われます。得られたcDNAは、標準的なPCRのテンプレートとして使用できます。AMV RTは、使用するプライマーの種類によって決定される部位で新しいcDNA鎖を合成します。

• poly(A) mRNAの3'末端：Oligo-p(dT)₁₅をプライマーとして使用する場合
• mRNAテンプレートに沿った非特異的ポイント：ランダムプライマーp(dN)₆を使用する場合
• 配列特異的プライマーによって決定される部位

RNAの取り扱い

短期保存：
再懸濁したRNAは、RNaseフリーバッファーTEバッファー（10 mM Tris、1 mM EDTA）またはRNaseフリーH₂O（0.1 mM EDTAを含む）に-15〜-25 ℃で保存するのが最適です。
注記：RNaseフリーであることがわかっているEDTA溶液を使用することが重要です（長期間保存されたEDTA溶液には、微生物が増殖している可能性があり、ヌクレアーゼによるRNAサンプルの汚染を招きかねません）。RNAは通常、-80 ℃で最大1年間安定性を維持します。

長期保存：
RNAサンプルはエタノール沈殿物として-80 ℃で長期保存することもできます。
注記：RNAは、-80 ℃の酢酸アンモニウム／エタノール沈殿混合物内で最も安定します（ただし、必要な場合は、RNAを水またはバッファーに再懸濁して-80 ℃で保存することもできます）。

精製RNAの代替保存法：
RNAをペレットとして70%エタノールに保存するか、再懸濁したRNAに2倍量の100%エタノールを加えて保存します。RNAを回収するには、酢酸ナトリウムを加えて遠心分離します。

一般的に、RNAサンプルをいくつかのチューブに小分けしておくことが推奨されます。こうすることで、凍結融解を繰り返すことによるRNAの損傷を防ぐだけでなく、不注意によるRNaseのコンタミネーションも防ぐことができます。

RNAの回収と溶解：
遠心分離後、RNAを37 ℃または真空オーブンで短時間乾燥させる必要があります。
注記：RNAの再懸濁が困難になるため、RNAペレットを完全に乾燥させないでください。RNAを取り扱う際には、すべてのサンプルを氷上に置きます。上記の理由により、RNAは室温で分解されやすくなります。RNaseフリーTEバッファー（10 mM Tris、1 mM EDTA）またはRNaseフリーのH₂O（0.1 mM EDTAを含む）を加えてRNAを溶解します。次に、チューブを氷上で15分間インキュベートします。チューブを軽くたたくか慎重にボルテックスして、RNAを再懸濁します。

下流用途のためのRNAの沈殿：
より濃縮された精製RNAが下流用途で必要な場合は、酢酸アンモニウム（NH₄OAc）の沈殿（0.1容量の5 M NH₄OAc、および2〜2.5容量の100%エタノール、-20 ℃で25分以上）により、RNAの優れた回収率が得られます。低濃度のRNA（ng/mL）を定量的に回収するには、グリコーゲン、酵母RNA、線状アクリルアミドなどの不活性共沈剤を使用する必要があります。