ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のアプリケーション

ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は分子生物学の中で中核的な役割を担う強力な手法であり、効率的かつ迅速なin vitro法でさまざまな材料から特定のDNAまたはRNA配列を酵素を用いて増幅します。標準的なPCRは以下の要素から構成されます：標的DNA、合成オリゴヌクレオチドプライマーのセット（標的DNA配列を側面から攻撃）、熱安定DNAポリメラーゼ（通常はTaqポリメラーゼ）、ヌクレオチド。サーマルサイクラーによる増幅サイクルは、1回のサイクルごとに以下の3ステップが進行します：二本鎖DNA（dsDNA）を変性させて単鎖DNAへ分離、標的DNAの配列に合わせてプライマーをアニーリング、最後に伸長。最後のステージでは、DNAポリメラーゼがプライマー由来のDNAを伸長して新しいdsDNA（オリジナルの鎖と新規作成した鎖を持つ）を生成します。1回のサイクルで合成された鎖を次回のサイクルでテンプレートとして使用することにより、20回のサイクルでDNAの量が100万倍にも増幅されます。  

逆転写PCR（RT-PCR）

RT-PCR（逆転写PCR）は標準PCR法の変形の1つであり、非常に小さなサンプルから取得した特定のmRNAの増幅過程を含むことを特徴とします。標準的なクローニング法で必要となる退屈なmRNA精製プロセスを省略できるのが利点です。RT-PCRでは、標準PCR試薬に加えて、逆転写酵素とRNAサンプルを使用します。反応混合物を37℃まで加熱することにより、逆転写酵素がRNAサンプルから相補的cDNAのコピーを作成できるようにします。このcDNAがプライマーの1つにアニーリング（対合）することによって、第1鎖が合成されます。それ以後は標準PCRと同じプロセスが繰り返され、最終的にdsDNAが作成されます。RT-PCRはしばしばリアルタイムPCR（qPCR）と組み合わせて使用されることがあり、この手法は細胞や組織内での転写レベルを定量する目的で広く使用されています。

ホットスタートPCR

ホットスタートPCRは、加熱による活性化段階が開始されるまで反応設定中のホットスタートTaqポリメラーゼまたは修飾dNTPの取込みを阻害する技術です。ホットスタートポリメラーゼの活動を阻むために使用できる方法は、化学修飾、抗体媒介、アプタマー媒介法を含めてさまざまな方法が存在します。 

長鎖標的を正確に増幅するエンドポイントPCR

標的の存在検出や反応完了時における相対的存在量の確認を目的としてエンドポイントPCRがしばしば使用されます。標準PCRを使用して作り出される配列の長さは限定（5kb程度）されますが、「校正」活性を示す追加ファクターを組み込むことによって問題を克服できることがあります。LA（Long and Accurate）PCRは第二の熱安定ポリメラーゼ（末端ヌクレオチド誤取り込み修復のためにエキソヌクレアーゼの位置が3′→5′へ変化）を組み込むことによって、長さが40 kbに達するDNA標的を増幅することが可能であり、フィデリティもはるかに優れています。