変動性をもたらすさまざまな要因は、PCRのワークフロー全体に影響を及ぼします。サンプルの原料や逆転写ステップの要件など、可変コンポーネントの多くは避けられません。アッセイデザインも変動性が高く、PCRの成否を分けうる要因であると同時に、アッセイの再現性や感度に貢献する要因でもあります。アッセイデザインのプロセスは以下のように論理的な流れに沿っています。第一のステップでは、目的の標的位置を決定します。たとえば、SNP検出のように、オリゴ配列が用途によって決まり、回避できない場合もあれば、コピー数の測定のように、遺伝子全体が使われる場合もあります。アッセイ対象となるおおよその部位を選択したら、最適なプライマーを同定し、修飾を決めます。アッセイをマルチプレックスで実施する場合は、反応中にすべてのオリゴが相互作用する可能性について考慮するとともに、標的の相対存在量についても考慮しておくことが重要です。たとえば、コピー数が非常に少ないものや標的濃度にほとんど差がないものの検出を目的とする場合などの難しい状況においては、複数のプライマーの組み合わせを選択して試した上で、適切なプローブと組み合わせることをお勧めします。
アッセイデザインのプロセスは、適切なデザインソフトウェアを採用することで大幅に容易になります。OligoArchitectには、デザインサポートに関して2つのオプションがあります。第一のオプションは、幅広い選択肢を持つソフトウェアデザインツールのOligoArchitect Onlineです。アッセイデザインに特殊な機能が求められる場合は、第二のオプションとしてOligoArchitect Consultativeを介してデザインを依頼し、メルクの分子生物学専門スタッフのサポートを受けることができます。
アンプリコンの選択
アンプリコンとは、解析対象とする標的配列領域のことであり、フォワードおよびリバースPCRプライマーで囲まれています。アンプリコンの適切なサイズは、解析に用いる方法によっても左右されます。たとえば、ゲル電気泳動によってPCR断片を可視化する場合は、PCR断片がDNA結合色素を使用して効率的に染色するのに十分な大きさであり、かつ選択した人工サイズマーカーの範囲に収まることが必要です。同様に、キャピラリー電気泳動装置によってPCR断片を分離する場合、PCR産物は100塩基対から2 kb超の範囲内になります（最終的には酵素の働きによって制限されます）。
qPCRの場合は、各サイクルで正確に定量できるよう、より小さなアンプリコンを選択します。デザイン上の制約からプライマーがこの範囲外にならない限り、理想的なqPCRアンプリコンのサイズは、75～200塩基長程度です。実際には、断片サイズは、対象となる生理現象等の要因を考慮して決定されます。
アッセイの位置は、実験の目的によってあらかじめ決まっている場合があります。mRNA標的の有無を調べたり、定量を行ったりするアッセイは、混入したgDNA配列の検出を避けるため、エキソン-エキソンジャンクションに置くのが理想的です。しかし、これらの領域は高度に折りたたまれていることが多いため、潜在的にパフォーマンスの劣るエキソンスパニングアッセイや高品質のエキソンアッセイの選好に関しては、実際的な決定が必要となります。mRNAが十分に存在し、単一コピー遺伝子から転写される場合、gDNAのコンタミネーションによるシグナルの寄与は、多コピー遺伝子から転写される低量のmRNAを検出する場合と比べてかなり小さいものとなります。SNP検出では、プローブやプライマーの3'末端側がミスマッチ部位に位置する必要があります。
スプライス変異の解析には、目的に応じた特殊なデザイン手法が必要です。すべてのスプライス変異を同時に検出することが望ましい場合もあり、これは単に、すべての変異で保持されているエキソンの境界を選択することで達成できます。その一方で、各スプライス変異の差次的発現に関する調査には、さらに独創的なアプローチが必要となります。こうした実験の一例では、図6.1に示すように異なる転写産物のどれが発現しているのかを調査することが目的となります。エキソンは比較的小さいため、スプライス変異の増幅から得られるさらに小さな産物とともに、すべてのエキソンに及ぶ増幅から、300塩基程度の産物がもたらされます。この試験のデザインオプションとしては以下が考えられます。
- 各エキソンジャンクションにわたる複数のアッセイをデザインし、各サンプルをアッセイごとに精査します。
- エキソン1の3'末端とエキソン4の5'末端に対するプライマーをデザインします。いずれかのエキソンの組み合わせから構成される転写産物の増幅により、特定の長さのアンプリコンが得られます。転写産物の定義は、qPCR（反応後のSYBRグリーンI染色による融解曲線）を用いて規定されます。
図6.14つのスプライス変異として発現する可能性がある遺伝子の略図。スプライス変異はそれぞれ、各エキソンジャンクションにわたる特異的プライマー対のデザインによって区別されるか、エキソン1と4にある一般的なプライマー対からの増幅、およびqPCR（SYBRグリーンI蛍光色素による融解曲線分析）を用いたスプライス変異の識別によって区別される。
一般的に、アンプリコン配列は以下の基準に照らして評価する必要があります。
- 標的配列領域の初期評価を実施することが推奨されます。
- 予期せぬSNPがないことを確認します。プライマーとテンプレート間のミスマッチが1つあるだけで、融解温度が最大10 ℃低下し、PCRの効率に影響を及ぼす可能性があります。
- 選択した配列が、標的種のゲノムやトランスクリプトーム中の他のどのような配列とも相同性をもたないことを確認します。多微生物系を標的にする場合（たとえば病原体の検出など）は、相同性アラインメントに、サンプル中に存在する可能性のあるすべての配列を含めなければなりません。
- OligoArchitect（選択したデザインソフトウェア）またはmfold（http://mfold.rna.albany.edu/）の折りたたみアルゴリズムを用いた二次構造を標的配列が採用できるかどうかをテストし、希望のプライマーアニーリング温度でのテンプレートの折りたたみをモデル化します。非常にネガティブなΔG値を持つステムループ二次構造を回避することにより、予測される開放構造を持つテンプレート領域を選択します。これは、1ステップの逆転写プロトコルと遺伝子特異的なプライマーを使用する際に考慮すべき重要な点です。
- パリンドローム配列と反復領域は避けてください。
- 約50%のGC含量を目指して、G/Cリッチ領域が生じるのを回避します。
- マルチプレックスアッセイをデザインする場合は、バイアス増幅を避けるために、アンプリコンの長さとCG含量をできるだけ類似させる必要があります。
- 遺伝子ファミリーのアッセイをデザインする場合は、（必要に応じて）相同性のある領域と不均一な領域を特定します。その後、配列を調整して、適切なコンセンサス配列の延長について検討する必要があります。
- 転写産物特異的なデザインについては（gDNAテンプレートの検出を避けるため）、可能な限りエキソン-エキソンジャンクションに及ぶ領域を標的にします。
転写産物特異的なアンプリコンの選別
すべてではないまでもほとんどのDNAは、RNA精製中にサンプルから除去されます。RT-qPCR中のDNA増幅を回避するため、mRNA配列に存在しない大きなイントロンに隣接しているプライマーか、エキソン-エキソンジャンクションにまたがっているプライマーを選択することをお勧めします（図6.2）。
多くの脊椎動物、細菌類、原生生物、真菌、植物、および無脊椎動物の後生動物種からの既知の遺伝子に対するイントロン/エキソンに関する注釈は、EnsemblGenomesのウェブサイト（http://ensemblgenomes.org/）で閲覧できます。あるいは、標的遺伝子のゲノム配列とcDNA配列の両方が公開されている場合は、標的生物のゲノムデータベースに対してcDNA配列を使用してBLAST検索を行うことで、イントロンの位置を特定できます（図6.3）。図6.3のイントロン1は十分な長さ（約6.5 kb）であるため、従来のqPCR条件下または制御されたPCR条件下でDNAを増幅する必要がありません。ただし、他のすべてのイントロンは比較的短い（1kb 未満）ため、RT-qPCR（たとえば、アッセイの最適化と検証）中にDNAが増幅される可能性があります。プライマーは、エキソン-エキソン連結にまたがっているか、長い（数kb長）イントロンに隣接しているか、または複数の小さなイントロンに隣接している必要があります。
図6.2RT-PCRで用いられる（A）イントロンスパニングプライマーおよび（B）イントロン隣接プライマーの模式図。イントロンは赤、エキソンは緑で示す。プライマーP1およびP2はイントロンにまたがり、プライマーP3およびP4はイントロンに隣接している。アニーリング温度が極端に低くない限り、プライマーP1およびP2はDNAからPCR産物を生成しない。イントロンが短い場合（約1 kb）、P3およびP4はDNAから長めのPCR産物を生成する可能性がある。ただし、イントロンの長さが十分（数kb）な場合はこの限りではない。
図6.3ゲノムDNA配列を用いたcDNA配列のBLASTアラインメント。Genbankから得たラットp53の完全なcDNA配列（受入番号NM_030989）を使用して、ラットゲノム（blastn）内の同一配列のmegaBLAST検索を実行した。第10染色体上のgDNAに対するcDNAのアラインメントが示されている。この情報を用いて、cDNAのエキソンを対応するgDNA領域にアラインメントすることができる。プライマーのデザインは、長いイントロンによって分離されたエキソン、たとえばエキソン1および2に向けられる。
メチル化特異的アッセイ
DNAのメチル化は、細胞分化の極めて重要な部分にあたり、安定した方法で遺伝子発現を変化させます。メチル化は、高等生物の正常な発達にとって重要であり、遺伝的に継承されうるものです。DNAメチル化による遺伝子発現の抑制には、シトシンピリミジン環の5位またはアデニンプリン環の窒素6へのメチル基の付加が伴います。成人の体細胞組織では通常、DNAメチル化がCpGジヌクレオチドとの関連で発生するのに対し、胚性幹細胞では非CpGメチル化が一般的です。メチル化特異的アッセイでは、配列内、多くの場合遺伝子プロモーター領域内のCpGアイランドを特定する必要があります。Beacon Designer（Premier Biosoft）を使用すると、この情報を自動的に見つけて、http://www.mybioinfo.info/index.phpで閲覧できます。
プライマーのデザイン
本章に記載する一般的なプライマー／プローブデザインは、遺伝子発現研究、SNP検出、メチル化検出試験、コピー数の測定、ウイルス量のモニタリング、スプライス変異の定量化などの数多くの用途に適用可能ですが、用途ごとに個別のデザイン上の考慮事項もあるため、個々に説明します。
プライマーに関する一般的なデザイン基準
ほとんどの用途について、プライマーは、プライミングの対象とするテンプレートDNA配列に完全に相補的になるようデザインされています。PCRプライマーの基本的なデザイン上の考慮事項として、以下が挙げられます。
- プライマーは通常、qPCRの場合で長さが20～24ヌクレオチド、融解温度（Tm）が約60 ℃（59±2 ℃）ですが、
一般的なPCRでは異なることもあります（55±5 ℃）。用途によっては、プライマー長やTmに個別の変更が必要な場合もあります。 - プライマー対のGC含有率は40～60%程度とし、大きな影響を与える二次構造を持たないようにしてください。
- プライマーは、特に3'末端でプライマー自体または対になるプライマーに相補的であってはなりません。これにより、増幅中にプライマーダイマーが形成される可能性が低減します。
- 3' clampは避けてください（3'末端の5塩基を検査し、そのうち3塩基をAまたはT、2塩基をGまたはCとして受け入れます）。
- 4つの反復領域またはパリンドローム領域よりも長い同一ヌクレオチドの操作は避けてください。
SNP特異的プライマー
一塩基変異多型（SNP）アッセイをデザインする場合などのように、アッセイの位置に柔軟性がなく、周辺配列も選択したオリゴの配列に影響を与えることがあります。臨床症状が生殖細胞系列および後天的な体細胞SNPの双方と相関するという認識から、さらに高感度で特異的な検出システムの開発に多大な努力が払われています。このことは、オリゴハイブリダイゼーションを用いたSNPの識別に関する困難な側面を反映しています。こうした課題は、異なるミスマッチ間の不安定性の違いに起因しています。G:A、C:T、およびT:Tが強力な不安定化効果を有する場合は、水素結合が形成されている可能性があり、天然のG:CおよびT:Aから区別しにくくなるため、G:TおよびC:Aがはるかに弱くなります。多くのシステムは、これまでに広く使用され嚢胞性線維症突然変異2のスクリーニングに有益であった増幅難治性突然変異システム（ARMS）1を改変したものです。ARMSプライマーは、30塩基長です（これよりも長いプライマーでは、最大で60塩基が機能的です）。3'末端はSNP特異的であることから、標的配列（正常または変異塩基）にとっても特異的です。追加のミスマッチを末端から2番目の位置に導入します。これは、隣接する塩基とSNPミスマッチを考慮して決められます（Little（2001年）より引用した表6.1を参照）。
『Current Protocols in Human Genetics』（Little, S. 2001.Amplification-Refractory Mutation System (ARMS) Analysis of Point Mutations.Curr.Protoc.Hum.Genet.7:9.8.1–9.8.12）より許諾を得て転載した。
これと同様の考え方は他の研究グループでも採用され、プライマーのN-2およびN-3の位置にミスマッチを導入する有用性が示されています。Liu等3は、不安定化効果を最大にする、すなわち特異性が最大となるミスマッチの相対的な位置について綿密な解析を行っています。
マルチプレックスPCR
1つのチューブでより多くのPCRを行ってスループットを上げたい場合、あるいはサンプルを節約したい場合は、マルチプレックスPCRで複数の標的の増幅を同時に行う必要があります。プライマーデザインは、マルチプレックスPCRの成否を決める最も重要な要因です。一般的なガイドラインに則って行い、かつ反応に関わるすべてのプライマー（およびプローブ）について適合性を確認することが非常に重要です。Tmが約65 ℃程度のやや長めのプライマーを使用すると有益な場合があります。得られたアンプリコンをサイズ別に解析する場合は、アッセイをデザインする際に解析の分解能を考慮する必要があります。qPCRを用いて複数の標識を定量化する場合は、増幅バイアスを回避するため、アンプリコンが可能な限り類似していることが求められます。PCRを妨げる安定的な二次構造を、プライマーだけでなくテンプレートも有さないようにすることが重要です。標的の濃度に大きなばらつきがあることがわかっている場合は、低濃度の標的を正確に検出しやすいように、高濃度の標的に対するブロッキングプライマーを用いることが有効なこともあります4。
Non-coding RNAの定量
コーディングゲノムとは対照的に、ヒトトランスクリプトームの約97%がNon-coding RNA（ncRNA）で構成されていると考えられています5、6、7。このファミリーの一つが、RNA調節分子系と言われてきたlong non-coding RNAです。これらの分子は、エピジェネティクス、発達、ガン、および本質的な生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たします8、9。Long ncRNAとは、これまで、200塩基以上のRNA鎖からなるものとして定義されています10、11、12。つまり、アンプリコンの長さを認識した後は、これらの標的に対するデザインを行う際に、すでに言及したもの以外に特別に考慮する必要のある事項はありません。
これに対して、microRNA（miRNA）からなるファミリーメンバーには、デザイン上重大な課題があります。21〜23 ntのshort non-coding RNA（sncRNA）は、転写産物を処理する段階で複雑な細胞経路を介して生成されます。microRNAは、転写産物と結合することによってタンパク質の翻訳を逆方向に調節し（Kato等の2008年の著書で概説13）、RNA誘導型サイレンシング複合体（RISC）の形成を誘導します14。MystiCq®などの市販のアッセイは、miRNAに伴うデザイン上の課題を解決する好適なソリューションです。miRNA解析用のqPCRにはいくつかのスキームが提案されており15、市販の製品がない生物の研究者向けに、解決策のアイデアについて説明した文献が発表されています。こうした解決策の多くは、アダプターのライゲーション（Casoldi等による『PCR Technologies; Current Innovations』、Nolan編集の第22章16）により、またはポリAポリメラーゼ（PAP）を用いてポリA末端を付加することにより17、元のmiRNAに数塩基を付加するものです。miRNA特異的なプライマーにそれぞれタグを付加することで、ハイブリダイゼーションのTmの最適化が可能となり、DNAプライマーを含む反応は、Locked Nucleic Acidでスパイクしたものよりも効率がよいことがわかっています18。このレポートでは、miRNAに特異的なDNAプライマーは、従来のPCRプライマーガイドラインを用いてデザインされましたが、以下の点も考慮されています。
- miRNA配列を調べて、3'末端にあるA塩基をすべて無視します。• フォワードプライマーを、5'から3'末端の末端4塩基までの配列で最も長いものとします（上記で特定したA塩基は無視します）。
- フォワードプライマーの3'末端にある2塩基のうち一つはAまたはTであることが好ましいです。
- 3'末端の3塩基にAまたはTが1個または2個含まれていることが好ましいです。
- 3'末端の5塩基にAまたはTが2～3個含まれていることが好ましいです。
- 最近傍アルゴリズムを用いてフォワードプライマーのTmを解析します。59 ℃未満であれば、5'末端に所定の順序で塩基（G、A、C、G、C）を付加し、付加するごとにTmを計算します。結果的にCGCAGN18というプライマーが得られます。ここでNは、miRNA特異的な塩基とします。Tmが59 ℃に最も近い最短のプライマーを選択します。59 ℃以上の場合は、5'末端の塩基を除去し、塩基を除去するごとにTmを計算します。Tmが59℃に最も近い最長のプライマーを選択します。
- リバースプライマーについては3'末端の塩基を選択して、フォワードプライマーと相補性がないことを確認します。フォワードプライマーについて説明するとおりに、末端の5塩基を評価します。
- プライマーに15 個のTを付加します（たとえば5’ T15 N5 3’）。
- 最近傍アルゴリズムを用いてフォワードプライマーのTmを解析します。59 ℃未満であれば、プライマーの5'末端に所定の順序で塩基（G、A、C、C、T、G、G、A、C、C）を付加し、付加するごとにTmを計算します。結果的にCAGGTCCAG T15 N5というプライマーが得られます。ここでNは、miRNA特異的な塩基とします。Tmが59 ℃に最も近い最短のプライマーを選択します。
- RTプライマーはCAGCTCCAG T15 V Nとします（ここで、V＝A、C、Gであり、N＝A、C、G、Tです）。
プライマーデザインの例
標的配列がプライマー配列を決定するため、必ずしも所望のデザインの基準を達成できるとは限りません。したがって、アッセイデザインでの妥協は、アッセイ特異的な最適化によって打開します。PCR標的の中には、良好なアッセイをデザインする以前に、特別な処理を必要とするものがあります。よくあるケースとしては、ウイルスなどを含む病原体の検出に関わるものがあります。多くのウイルスが、ゲノム内の特定の位置に高度な可変性を有することはよく知られています。B型肝炎ウイルス（HBV）がその好例です。最近の研究では、既知のHBVの変異型19に対する良好なqPCRアッセイをデザインするには、得られる限りすべてのHBVゲノム配列の大規模なアラインメントを行う必要がありました。一般的なアッセイデザインに使用できる、有意な長さのコンセンサス配列を見つけるため、ClustalWを用いて数百配列を比較していました。こうしたアラインメントの一部を図6.4に示します。アスタリスク（*）は、全ゲノムの解析で見つかったコンセンサスヌクレオチドを表しています（このアラインメントの一部である大多数の他の配列については、紙面の制約があるため掲載していません）。
図6.4HBVゲノムデータのClustalW解析の一部。ClustalWを用いて既知のHBV配列をアラインメントし、保存されているヌクレオチドをアスタリスク（＊）で示した。
こうした状況でプライマーおよびプローブをデザインするときは、混合塩基を含むオリゴ（「ゆらぎ塩基」または変性塩基とも呼ばれる）を使用する必要が生じる場合があります。たとえば、HBVについて示されたコンセンサス配列（図6.5）について詳細に考えてみます。
図6.5コンセンサス領域を示すHBVアラインメントの選択された領域
プライマーには約23塩基の領域が必要とされます。この場合、すべてのHBVゲノムに関する配列の可能性をすべて考慮すると、実際の23塩基の領域の配列は、図6.6に示すとおりになります。
図6.6選択したプライマーのコンセンサス領域について、塩基の全選択肢に対応するプライマー配列の置換。
あいまいな塩基の位置は、混合塩基については標準的な1文字表記を用いて示すことができます（表6.3）。図6.5および6.6に示す配列にこれらを当てはめると、オリゴは図6.7に示すようなものになります。
A ＝アデノシン、C ＝シチジン、G ＝グアノシン、T ＝チミジン
図6.7コンセンサス領域のオリゴのあいまいな塩基を標準的な1文字表記で示す。
縮重塩基の数が多いことに関して対処する必要のある追加の考慮事項があるため、このオプションで良好なPCRプライマーが得られる可能性はほとんどありません。実際、この配列を使用して作製された合成オリゴからは、可能な限りの単一の塩基配列をそれぞれ含む混合物が得られます。可能な限りの個々のプライマー配列の数は、各位置にある個々の塩基数を乗算することで算出されます。この配列では、得られる可能性のあるオリゴは、1×2×1×1×2×1×1×2×2×1×3×2×1×2×2×2×2×1×1×2×2×1×1 = 6,144通りになります。したがって、反応中の特異的な各オリゴの有効濃度は比例的に減少します。実証的分析からは、プライマーにおける異なる配列置換の数を512以下にすべきであることがわかっているため、この例は最適な縮重塩基プライマーとは言えません。解決法としては、別の位置でデザインし直すことが考えられます。図6.8に示す例では、プライマーにミスマッチの可能性がある2塩基が含まれていますが、これらはそれぞれ、単一の代替塩基を有するため、混合合成後に4つのオリゴが得られ、wobblesはプライマーの5'末端領域に位置しています。これらの要因により、図6.7に示したプライマーよりも成功の可能性がはるかに高くなります。
図6.8アラインメントコンセンサス塩基を示す配列と、コンセンサス領域に対するプライマーの位置の候補。コンセンサスプライマーはwobbleコードを用いて示す。
PCRで変性オリゴを使用する場合は、増幅プロトコルの改変が必要になることがあります。サイクル反応は、低いアニーリング温度（35～45 ℃）で2～5サイクルから開始できます。また、アニーリング温度から伸長温度まで、約3～5分かけてゆっくり上昇させることが望ましいとされています。その後、このプロトコ－ルは、温度傾斜を改変せずに、より厳しいアニーリング温度で25～40サイクル反応を実施して終了となります。
可能であれば、ヌクレオチドの不均一性は回避してください。不均一な領域を回避できない場合（標的の難度が高い場合によくある）、イノシンなどの特殊なオリゴ修飾や、5-ニトロインドールなどの「ユニバーサル」塩基を使用すると、煩雑さを抑えることができます。Locked Nucleic Acid（定量的PCRおよびデジタルPCR検出法）などの修飾基の付加により、パフォーマンスが向上する場合があります。
プライマーの改変
修飾ヌクレオチドはPCRプライマーに取り込むことが可能です。一般的な例としては、Locked Nucleic Acid塩基の付加が挙げられます。Locked Nucleic Acidは、RNA修飾ヌクレオチドです。Locked Nucleic Acidのリボース部分は、2'酸素と4'炭素をつなぐ追加の架橋で修飾されており（定量的PCRおよびデジタルPCR検出法）、この架橋が3'-endo型構造でリボースを「ロック」します。Locked Nucleic Acidは、所望に応じてオリゴヌクレオチド内のどのような位置であってもDNAまたはRNA塩基に混成できます。Locked Nucleic Acid修飾により、熱安定性が増し、修飾していない長いプローブと同等のTmを有する短いプローブをデザインすることが可能になります。Locked Nucleic Acid含有配列は、DNAのみからなるオリゴよりも特異性が高く、SNPの検出に理想的です。Locked Nucleic Acid修飾のその他の用途としては、高度な可変性があるために一般的なアッセイをデザインするのが難しい、ウイルスなどの高難度の配列の解析用オリゴをデザインすることが挙げられます22。
プローブのデザイン
PCRプライマーについては、qPCRプローブのデザインも、配列の条件や所望の用途に大きく依存します。両末端標識プローブやモレキュラービーコンのような単一のプローブは、通常20～30塩基長です。Scorpions®プローブの長さは、15～25塩基と短めです。LightCyclerまたはFRETシステムには、1～ 5塩基程度離れて近接して位置するセンサープローブ（プローブ1）とアンカープローブ（プローブ2）という2つのプローブがあります。
- 両末端標識プローブを使用する場合は、プライマーがハイブリダイズして伸長する前にプローブを標的に確実に結合させるため、プローブのTmをプライマーよりも7 ℃～10 ℃高く設定する必要があります。これは反応中のFRETプローブについても同様です。SNP検出に用いる場合、センサープローブ（プローブ1）は、プローブの末端3塩基を避けてミスマッチの部位に渡って位置し、アンカープローブ（プローブ2）よりも低いTmを有します（約5 ℃）。Scorpions®プローブは、他のプローブシステムのように伸長反応前ではなく、その後に新たに合成されるテンプレートに結合するため、この推奨の例外となります。
- 両末端標識プローブを使用する定量試験では、フォワードプライマーの3'末端付近にプローブが位置することを目標にしますが、重複させないようにします（約5塩基）。SNP検出の場合は、両末端標識プローブまたはモレキュラービーコンがアンプリコンの中央にくるようにし、SNPがプローブの中央にくるようにします。
- クエンチングの原因になるため、グアニジンがプローブの5'末端（レポーターの隣り）にならないようにします。
- プローブ配列でCよりもGが少なくなるようにします。
- 同一塩基配列や（4未満）やパリンドローム配列は避けてください。
- プローブが二次構造を有さないようにすることが重要です。
- プローブがプライマーにハイブリダイズできないことを確認します。
- マルチプレックス反応用のプローブをデザインするときは、プローブとプライマーがいずれも相互反応する可能性がないことを確認してください。
モレキュラービーコン
適切なプローブ領域を選択後、相補的なステムを5'末端と3'末端に付加してモレキュラービーコン構造を作製します20。以下に示す例では、両末端標識プローブにステム配列（赤色で表示）を付加してモレキュラービーコンを作製しています（Thelwell（2000年）より引用した図6.9を参照21）。
図6.9モレキュラービーコンフォーマットへの両末端標識プローブアッセイの適応。Oxford University Pressによる『Nucleic acids research』より引用。Copyright Clearance Centerを通じ書籍／電子書籍での再利用についてOxford University Pressの許諾を得て転載した。
Scorpions®プローブ
Scorpions®プローブの場合、5'蛍光色素-ステム–プローブ-ステム–クエンチャー–ブロッカー–プライマーという構造を取るように、フォワードプライマーとプローブを組み立てる必要があります。このプローブはプライマーと同一鎖上で新たに生成されるテンプレートに結合するため、プライマーとは反対の鎖になくてはなりません。図6.10に示す例では、ラベル、クエンチャー、PCRブロッカーおよびステム配列が両末端標識プローブに付加されて、Scorpions®プローブが生成されています（Thelwell（2000年）より引用21）。
図6.10Scorpions®プローブフォーマットへの両末端標識プローブアッセイの適応。Oxford University Pressによる『Nucleic acids research』より引用。Copyright Clearance Centerを通じ書籍／電子書籍での再利用についてOxford University Pressの許諾を得て転載した。
プローブの修飾
望ましくない不均一性を有する配列の領域上にプローブが配置されている場合、あいまいな塩基はPCRプライマーについて説明したように管理されます。同様に、Locked Nucleic Acidは、プライマーに追加されるのと同じ理由でプローブに追加されることがあります。
単一アッセイの場合は、両末端標識プローブ、モレキュラービーコン、またはScorpions®プローブの5'末端をフルオロフォア（通常は6-FAM™）で標識し、マルチプレックスする場合は、通常、FAM、HEX™／JOE™、シアニン5の順でフルオロフォアを選択します（機器と標識の適合性を確認することが重要です）。両末端標識プローブまたはモレキュラービーコンの3'末端と、Scorpions®プローブの内部ステム領域の3'末端をクエンチャー分子で修飾します。これまでは、TAMRA色素をFAM発光のアクセプターとして使用してFAMをクエンチングさせていました。ダーククエンチャー技術の開発により、Black Hole Quenchers®が広く採用されるようになり、さらに最近では、メルクのOnyx Quencher™も導入されています（定量的PCRおよびデジタルPCR検出法）。
テンプレートコントロール
通常、150塩基未満と比較的短いアンプリコンを使用する利点の一つは、その後に人工の増幅標的として使用できる長いオリゴヌクレオチドの合成が可能となる点です。たとえば、インヒビションコントロールアッセイSPUD23（付録A）や感染症検出研究19などのように、対象となる標的が希少であるか不足している場合は、アッセイの開発や最適化にこうした標的を使用すると効果的です。
オリゴDNAの合成および取り扱い方法
PCR用途で使用するためにカスタムオリゴを注文するときは、希望する収量／合成スケール、純度、必要な修飾を決定する必要があります。こうした要因はそれぞれ互いに影響を与え、たとえば精製レベルが高ければ、オリゴヌクレオチドの品質が良くなるばかりでなく、全収量におけるコストが下がります。表6.4、6.5、6.6に、メルクが作製するオリゴヌクレオチドの合成スケールや収量に関するガイダンスをまとめました。
オリゴヌクレオチドの精製
DNAを合成するときに、配列の3'末端側から順に各ヌクレオチドを結合させます。各結合サイクルにおいて、オリゴ鎖のごく一部が伸長しないことがあり、結果として完全長の生成物と不完全な配列が混ざった状態になります。オリゴを担体から切断し、保護基を除去した後に、精製して不完全な配列から完全長の生成物を分離します。一般的に、特定の用途で求められる純度は、不完全なオリゴマーの存在に起因する潜在的な影響によって異なります。用途によっては、完全長の（n）オリゴのみが存在することが絶対条件です。一方で、PCRプライマーのように、短いオリゴ（n-1、n-2など）が混在しても実験結果に影響を与えない場合もあります。
脱塩精製
脱塩処理では、合成ステップ、切断ステップ、脱保護ステップで残された残存する副生成物を除去します。
圧倒的多数を占める完全長のオリゴは、短い産物からの影響を補ってあまりあるため、PCRを含む多くの用途では、脱塩精製が35塩基長以下のオリゴに適用可能です。クローニング用のオリゴや長さが35塩基を超えるオリゴについては、逆相カートリッジ精製（RP1）、HPLCまたはPAGE（塩基長による）などの追加の精製法が必要です。
逆相カートリッジ精製（RP1）
逆相カートリッジによる分離により、高い割合で不完全な配列を除去できます。分離の基本として、完全長産物と不完全な配列との間の疎水性の違いを利用します。完全長のオリゴがカラムに残留するのに対し、不完全な配列は洗い流されます。希望の完全長産物は溶出されてカートリッジから取り除かれます。
逆相HPLC
オリゴが長くなるにつれて、不完全な配列の割合も増える傾向にあります。これらの不純物がすべてRP1で除去できるわけではなく、人工のアンプリコンテンプレートオリゴや標識プローブオリゴなどの長いオリゴについては、HPLCまたはPAGE精製が推奨されます。逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）の場合も、逆相カートリッジと同様の原理で処理を行います。ただし、高純度の場合でも高い分解能が得られます。qPCRプローブのようなフルオロフォアで標識されたオリゴに本来備わっている親油性が混入物質から生成物を非常に良好に分離するため、HPLCは、こうしたオリゴにとって効率のよい精製法となります。さらに、RP-HPLCは、カラムの処理能力や分離能があることから、スケールの大きな場合に選択する精製法です。親油性に基づく分離能はオリゴが長くなるにつれて減少します。したがって、RP-HPLCは通常、50塩基を超える長さの生成物の精製には推奨されません。この方法を用いて長いオリゴ（最大80塩基）を精製することもできますが、純度や収量にはマイナスとなります。
陰イオン交換HPLC
陰イオン交換分離は、分子中のリン酸基の数に基づく方法です。陰イオン交換精製法では、第4級アンモニウム固定相カラムや類似構造体での塩濃度勾配による溶出を利用します。少量の精製では優れた分離能が得られます。分離プロセスに第二の側面を加えて、この技術をRP-HPLCによる精製と組み合わせることも可能です。陰イオン交換HPLCは、オリゴの長さ（通常は最大で40mers）に制限されます。オリゴヌクレオチドが長くなればなるほど、陰イオン交換HPLCカラムにおける分離能が低くなるため、ターゲットオリゴの純度も低くなります。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）
PAGEによる分離の基本は、分子量による電荷であり、良好なサイズ分解能が得られ、完全長産物の95～99%の精製レベルが実現します。ゲルからオリゴを抽出し大多数を占める不完全な産物を除去するのに複雑な手順を要するため、PAGEから得られる収量は、他の方法よりも低くなります。この方法は、純度の高い生成物が必要な場合に推奨されます。PAGEは長いオリゴ（50塩基以上）の精製に推奨されます。
*保証は20塩基以上のオリゴに対するものであり、短鎖オリゴは保証ODが低くなる場合があります。
*保証は20塩基以上のオリゴに対するものであり、短鎖オリゴは保証ODが低くなる場合があります。
注記：合成後の修飾収量は上記の値よりも50%少なくなります。
すべてのプローブはRP-HPLCで精製される。
オリゴヌクレオチドの調製
乾燥状態で供給されるDNAオリゴヌクレオチドは、再懸濁すればすぐに使用可能です。TE（10 mM Tris、pH 7.5～8.0、1 mM EDTA）のような弱いバッファーでオリゴヌクレオチドを再懸濁させることが推奨されています。TEが適さない用途では、ヌクレアーゼフリーの滅菌水を使用します。しかし、高純度水はやや酸性であることもあり、オリゴヌクレオチドの長期保存には推奨されません。
100 µMのストック溶液を以下のガイドラインに従って得ます。市販のオリゴのナノモル（nmol）数（チューブに貼付されたラベル、またはオリゴとともに供給される品質保証書に記載）を調べ、10倍にします。数マイクロリットルの液体をチューブに添加して最終濃度が100 µMになるようにします。たとえば、オリゴの収量が43.5 nmolであれば、100 µMのストック溶液を得るのに添加する量は435 µLです。これは、100 pmol/µLのストック溶液と同等です。用途の要件に基づき、必要に応じてストック溶液を希釈します。PCRでは、処理濃度は通常10 µMまたは20 µMとなります。ストック溶液を少量ずつ分けて–20 ℃で保存し、凍結溶解サイクルが複数回実行されることを避けてくだい。
参考文献
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