クローニング・発現

タンパク質発現ベクター

プラスミド、つまりタンパク質発現ベクターは、標的タンパク質のクローニングおよび発現のための多くの機能的要素を含む環状DNA断片です。適切な発現ベクターの選択は、タンパク質の種類、タンパク質を発現する生物、および研究者が取り組むことを目的とする特定のアプリケーションと科学的検証によって部分的に決定されます。多様な発現ベクターが利用可能であることにより、研究者は、どのクローニング、クローン選択、タンパク質発現要素が研究に最良であるかを選択することができます。標的遺伝子配列および発現ベクターを選択した場合、研究者は通常、ヌクレアーゼを用いて特定の部位で正確にベクターを切断し、標的遺伝子配列をインフレームでクローニングして、最終的に宿主生物で発現できるようにします。重要なこととして、研究者は一般に、組換えDNAプラスミドを導入するために化学的コンピテントセルおよび細菌形質転換を使用します。-70℃で凍結保存した場合に安定しているためです。

細胞トランスフェクション方法

細胞トランスフェクションは、DNAまたはRNAまたはタンパク質を真核細胞に導入するプロセスのことです。研究者は、タンパク質発現作業工程のこの部分を達成するために、多様な物理的、化学的、生物学的技術を利用できます。エレクトロポレーションなどの物理的方法、またはリン酸カルシウム（CaPi）、ポリエチレンイミン（PEI）、リポフェクション試薬などの化学的方法はすべて、一般的な手法です。レンチウイルス、オンコレトロウイルス、アデノウイルスなどのウイルス導入システムも、利用可能です。しかし、ウイルス送達法を用いるには、しばしば、バイオセーフティの理由から、さらなる生物学的封じ込めとモニタリングが必要になります。

タンパク質発現系

さまざまな生物が、標的タンパク質の発現のために研究者に使用されています。細菌は、発現ベクターを効率的に取り込み、倍加時間が短く、最適条件下で大量の組換えタンパク質を生成できるため、よく利用されます。しかし、細菌は原核生物なので、一部のタンパク質が必要とするタンパク質翻訳後修飾を提供することができません。酵母や哺乳類細胞株などの真核細胞は、タンパク質翻訳後修飾を促進することを目的として一般的に用いられています。組換えタンパク質発現のための最良の細胞株およびタンパク質発現戦略の選択は、具体的なアプリケーションニーズと、科学者が解明しようとする疑問に強く依存します。