ホットスタートPCR
PCR反応には、増幅のためのテンプレート配列、dNTP、緩衝液、dNTPの取り込みを酵素的に促進し、最終的に標的配列の新たなコピーを作製するためのTaq DNAポリメラーゼなど、いくつかの重要な試薬が必要です。ホットスタートPCRのメソッドと試薬の基本原理は、ホットスタートTaq DNAポリメラーゼ活性を阻害する、または熱活性化ステップが始まるまでの反応セットアップ段階で変性dNTPが取り込まれるのを阻害するよう設計されていることです。ホットスタートポリメラーゼの活性を阻害するために使用できる方法としては、化学修飾、抗体介在型、アプタマー介在型技術など、さまざまな方法があります。詳細な情報は、私たちの情報量豊富なHot Start PCRビデオをご覧ください。ホットスタートPCR技術や、この技術がお客様の標的特異性や収率をどのように改善するかについてさらに詳しく説明しています。
ホットスタートPCRプロトコル
ホットスタートPCR、ネステッドPCR、マルチプレックスPCRの利点
ホットスタートPCRの利点としては、標的配列の特異性と全体的な収率を低下させる可能性がある非特異的増幅やプライマーダイマーの形成が生じない室温での簡便なセットアップがあげられます。 ネステッドPCRやマルチプレックスPCRなどの別のPCR法では、複数のアンプリコンに対して特異性および高収率を達成するために、さまざまな試薬および戦略を使用します。ネステッドPCRでは2セットのプライマーを用います。第1のプライマーセットは1ラウンド目の増幅で標的配列のすぐ外側に配列を隣接させます。第2のプライマーセットは、1ラウンド目の増幅で得られた標的配列に特異的です。この標的配列が、このあとのネステッドプライマーを用いた第2ラウンドのPCRのテンプレートとして使用されます。マルチプレックスPCRは、高度に特異的な複数のプライマーセットを使用し、同一の反応中に複数の標的配列を同時に増幅します。それぞれのPCRメソッドは利点が異なるため、お客様の特定のニーズに基づいて選択する必要があります。
KOD Hot Start DNAポリメラーゼ・マスターミックス
KOD Hot Start DNAポリメラーゼは、2つの高度に特異的なモノクローナル抗体を用いて室温で3′→5′エキソヌクレアーゼ活性を阻害する、KOD DNAポリメラーゼのプレミックス複合体です。KOD Hot Start DNAポリメラーゼは、ミスプライミングやプライマーダイマー形成が発生しないため、ゲノムDNAテンプレート（最大12 kb）、プラスミドおよびλDNAテンプレート（最大21 kb）の長鎖増幅に理想的な試薬です。KOD Xtreme Hot Start DNAポリメラーゼは、最適化された酵素を用いることで長鎖かつGCリッチなテンプレートをPCR増幅できるため、植物組織やマウスの尾の先端など、未精製サンプルや増幅困難なサンプルからテンプレートを増幅することに成功しています。また、メルクのKOD Hot Start Master Mixは、KOD Hot Start DNAポリメラーゼ、dNTP、最適化された反応緩衝液を混合してすぐに使用できる2倍濃縮混合物を作成することで、オールインワンのソリューションを提供しています。
KODホットスタートゲノムおよびλDNA増幅
左側の図は、ヒトミオシン重鎖遺伝子（8.4 kb）とヒトβグロビン遺伝子（12.3 kb）のKOD Hot Start DNAポリメラーゼを用いたゲノムDNA増幅を示しています。右側の図は、λDNAが適切なプライマーとKOD Hot Start DNAポリメラーゼを用いて増幅されたことを示しています。M = マーカー
KOD Hot Start DNAポリメラーゼおよびMaster Mixのご購入では：お支払いの際にコード（SBJ）を入力すると20％割引！サービスは2019年12月31日に終了します－一部の国で有効です*。
FastStart™ Taq DNAポリメラーゼ・High Fidelity PCR System
FastStart™ Taq DNAポリメラーゼは、シングルターゲットのホットスタートPCR増幅およびマルチプレックスアプリケーションに理想的です。さらに、FastStart™ High Fidelity PCR Systemは、FastStart™ Taq DNAポリメラーゼおよび化学的に修飾された熱安定性プルーフリーディングタンパク質のブレンドを利用します。FastStart™ポリメラーゼとプルーフリーディングタンパク質はいずれも75℃以下では不活性であり、2分間だけ95℃に加熱し、保護基を除去することによって活性化されます。
ヒトゲノムDNAのFastStart™ High Fidelity PCR Systemによる増幅
ヒトゲノムDNAを用いて、tPA遺伝子の4.8 kbフラグメントを増幅しました。FastStart™High Fidelity PCR Systemは、他の2社の酵素よりも高い感度と特異性を示しました。
JumpStart™ Taq ReadyMix™・Taq DNAポリメラーゼ
抗体を介した阻害を利用するJumpStart™Taqポリメラーゼは、反応が70℃に達して抗体が酵素から解離した後にのみ活性化されます。抗体-酵素複合体であるため、標準的なホットスタートPCR、qPCRおよびマルチプレックスPCRのための、非特異的増幅を減少させた簡便な室温セットアップが可能になります。さらに、JumpStart™Tag ReadyMix™は、JumpStart™酵素の同じ機能と、オプションの不活性ゲルローディング色素入りのReadyMix™PCR反応ミックスにより提供される、PCRに必要な残りのすべての成分とを組み合わせています。
JumpStart™ REDTaq® ReadyMix™反応ミックスによるλファージ増幅
200 ngのλファージDNAを、SigmaのJumpStart REDTaq ReadyMix™（奇数番号レーン）と競合他社のDirect Load ReadyMix（偶数番号レーン）で増幅しました。
AptaTaq™ Fast DNAポリメラーゼ・AptaTaq™ Fast PCR Master
別のホットスタートPCR試薬では抗体を介したメソッドまたは化学修飾DNA Taqポリメラーゼを利用しますが、AptaTaq™ Fast DNAポリメラーゼは、室温での反応セットアップ中の非特異的増幅を阻害するためにアプタマー技術を組み込んでいます。さらに、AptaTaq™ Fast PCR Masterは、アプタマーを介したホットスタートTaqポリメラーゼと、DNAテンプレートおよびプライマーを除くすべての試薬を簡便に提供し、迅速な反応セットアップと反応時間のさらなる短縮を実現しています。70℃を超える温度で活性化されるAptaTaq™ Fast DNAポリメラーゼは、特定のプライミングや高速PCRアプリケーションに理想的です。
AptaTaq™ Fast PCR MasterによるPCR増幅
AptaTaq™Fast PCR Masterを用いたPCR反応は、競合他社のマスターミックスと比較して増幅に優れることが示唆されています。
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