凍結細胞株の解凍

ECACC Laboratory Handbook

4th Edition

ECACCなどの培養細胞株コレクションから得られた多くの培養細胞製品は凍結状態で到着するため、使用時に解凍し培養する必要があります。培養細胞の生存率を維持し速やかに復元するためには、正しく解凍することが重要です。DMSOなど一部の凍結保存剤は、4℃超で毒性を示します。したがって、毒性作用を最小限にするために培養細胞を速やかに解凍し、培地で希釈することが不可欠です。

関連製品

• 細胞培養培地：適切な温度であらかじめ加温します（正しい培地・温度については細胞株のデータシートをご参照ください）。
• 70%（v/v）アルコール/滅菌水（793213）
• DMSO（D2650）
• トリパンブルー溶液（T8154）

装置

• 保護用具（滅菌グローブ、ラボコート、フェイスシールド）
• 凍結アンプルを輸送するためのコンテナ（例えばドライアイス入りの箱）または液体窒素保存容器
• 適切な温度に設定したウォーターバス
• 適切な封じ込めレベルの安全キャビネット
• インキュベーター
• ラベル貼付済みフラスコ
• 倒立位相差顕微鏡
• 血球計算盤またはScepter™ Cell Counterのような自動セルカウンター
• 遠心分離機
• マーカー
• ピペット
• アンプルラック
• 組織

操作手順

1. ご使用の細胞株に最適な条件を設定するため、細胞株のデータシートを確認します。
2. フラスコを準備します。細胞株名・継代番号・日付をラベル表示します。
3. 適切な保護用具を着用し、液体窒素保存容器から細胞のアンプルを取り出します。液体窒素容器内またはドライアイス上で実験室に運びます。アンプルを慎重に取り扱うことは重要です。まれに、アンプルに残存した液体窒素の膨張により、加温時にアンプルが爆発することがあります。
4. 安全キャビネット内で、凍結アンプルのキャップ周囲を70%アルコールに浸したティッシュで巻いて保持します。キャップを4分の1捻り、トラップされているかもしれない残存液体窒素を放出します。キャップを再び締めます。アンプルを速やかに37℃のウォーターバスに移し、もしあれば、小さな氷晶が1～2個のみ残るようにします（1～2分）。速やかに解凍し、細胞膜への損傷を最小限にすることが重要です。
5. 注記：汚染リスクを高める可能性があるため、アンプルを完全に浸すことはしません。
6. 開封前に、70%アルコールに浸したティッシュでアンプルを拭き取ります。
7. アンプルの内容物全量を、ピペットで滅菌チューブ（例えば容量15 mL）に移します。その後、適切なサプリメントを添加済みの予熱した培地5 mLを徐々に添加します。トリパンブルーを使用して生細胞密度を測定します。適切な量の細胞懸濁液をフラスコに移し、細胞株のデータシート上で推奨される細胞密度で播種します。

8. 接着細胞株について：細胞株データシート上で推奨される細胞密度で播種するために、培地量を調整し、必要に応じてフラスコのサイズを調整します。最初の培地交換により残存する凍結保存剤は除去されると考えられるため、通常では凍結保存剤を除去する予備遠心操作は不要です。その場合、これはデータシートに明記されると考えられます。細胞が継代培養ではなくすぐに使用される場合（例えば細胞ベースのアッセイ）、凍結保存剤を除去する予備遠心操作の実施が望まれます。
   
9. 浮遊細胞株について：凍結保存剤を除去する予備遠心操作が推奨されます。すなわち、150 x gで5分、遠心分離により細胞をペレット化し、適切な量の新しい培地で細胞ペレットを再懸濁し、正しい密度で播種します。
10. データシートで推奨された温度およびCO₂レベルでインキュベートします。CO₂インキュベーターを使用する場合、フラスコはガス交換が可能なベントキャップにします。
11. 24時間後に細胞を顕微鏡（位相差）観察し、必要に応じて継代培養します。

キーポイント

1. 大半の教科書では、凍結保存剤を除去するため、培地で解凍細胞を洗浄することを推奨しています。これは、凍結保存剤が特定の細胞型に有害な作用を及ぼすことが分かっている場合にのみ必要です。例えば、一部の細胞株はDMSO存在下で分化することが分かっています。これらのケースでは、最終培養フラスコに添加する前に細胞を培地で洗浄します。
2. 培地への解凍した細胞懸濁液の添加は、効率的に凍結保存剤（例えばDMSO）を希釈し、凍結保存剤の毒性を低下させます。このため、アンプル解凍直後に大量の培地に解凍した細胞懸濁液を添加することは重要です。解凍したアンプルを長時間室温に放置しないでください。
3. インキュベーターや手のひらで温めて培養細胞を解凍しないでください。解凍速度があまりに遅く生存率低下をもたらします。上記プロトコルに記載されたとおりにウォーターバスを使用します。
4. CO₂インキュベーターが利用できない場合、フラスコに1～2分、0.2 μmフィルターでろ過した5% CO₂/95%空気を供給します。
5. 大半の培養細胞では、対数増殖期の細胞が凍結保存されており、新しいフラスコにすぐ播種できる最適な生存率であるため、コンフルエンスに達する前に継代培養するのが最善です。さらに、細胞の特性維持のため、コンフルエンス達成前に継代培養しなければならない特定の細胞株がいくつかあります。例えば、NIH3T3細胞がコンフルエンスを繰り返し達成すると、細胞の接触阻害機能は喪失します。
6. 一部のハイブリドーマは解凍後の増殖が緩慢になることがあるため、適切な培地に20%（v/v）FBSを加えて培養を開始します。