Znakowanie peptydami
Peptydy znakowane fluorescencyjnie i biotyną są nieocenionymi narzędziami w biochemii, mającymi liczne zastosowania w enzymologii, chemii białek, immunologii i histochemii. Oferujemy szeroką gamę odczynników znakujących do syntezy takich peptydów, w tym unikalne żywice NovaTag™ do produkcji peptydów znakowanych C-końcem.
Chromogeniczne znakowanie
Właściwości spektralne pochodnych chromogenicznych i fluorogenicznych Novabiochem® zostały podsumowane w Tabeli 1.
Jednym z najważniejszych zastosowań takich odczynników jest synteza substratów enzymatycznych wygaszanych fluorescencyjnie. Są to bardzo czułe narzędzia do badania specyficzności i aktywności proteaz, szczególnie w przypadku endoproteaz, gdzie konwencjonalne substraty znakowane karboksyterminalnie nie zawsze są odpowiednie. Takie substraty zazwyczaj zawierają fluorofor i grupę wygaszającą przyłączone po obu stronach miejsca rozszczepienia. W nienaruszonej cząsteczce naturalna fluorescencja fluoroforu jest tłumiona przez bliskość wygaszacza w procesie zwanym transferem energii rezonansu fluorescencji (FRET). Po rozszczepieniu substratu przez proteazę, wygaszacz i fluorofor zostają rozdzielone, co prowadzi do wzrostu fluorescencji, którą można następnie wykryć spektrofotometrycznie (Rysunek 1). Czułość jest określana przede wszystkim przez odległość między fluoroforem a wygaszaczem, która powinna mieścić się w zakresie 10-100 Å, oraz zakres nakładania się widma absorbancji wygaszacza i widma emisji fluoroforu. Zalecane pary fluorofor-wygaszacz są wymienione w Tabeli 1.
Żywice NovaTag™
Rysunek 1.Substrat peptydowy wygaszany fluorescencyjnie
Rysunek 2. Żywice NovaTag
Znaki są najczęściej umieszczane na N-końcu peptydu podczas syntezy w fazie stałej, ponieważ jest to bardzo proste z punktu widzenia syntezy przy użyciu pochodnych kwasu karboksylowego, takich jak biotyna-OSu, TAMRA itp. Dla wielu zastosowań korzystne jest jednak umieszczenie etykiety na C-końcu, szczególnie jeśli N-koniec jest wymagany dla aktywności biologicznej lub jeśli peptyd zawiera więcej niż jedną etykietę.
Co więcej, w przypadku substratów enzymatycznych opartych na FRET, często preferowane jest umieszczenie pary fluorofor/quencher na N- i C-końcu, a nie na łańcuchach bocznych aminokwasów, ponieważ pozwala to uniknąć modyfikacji natywnej sekwencji peptydu.
Żywice NovaTag™ są unikalnymi narzędziami zaprojektowanymi w celu usprawnienia Fmoc SPPS peptydów znakowanych chromogenem i biotyną1-3. Każda żywica zawiera standardowy, usuwalny TFA łącznik, który został zmodyfikowany tak, aby zawierał przekładkę diaminową, która jest chroniona ortogonalnie lub wstępnie derywatyzowana za pomocą chromogennej etykiety (Rysunek 2). Taki układ pozwala na szybkie i wydajne przygotowanie peptydów znakowanych C-końcem przy minimalnej liczbie etapów syntezy. Dostępne są wstępnie załadowane żywice, które po rozszczepieniu bezpośrednio dostarczają peptydy zawierające fluorofory (Dansyl, Mca, EDANS) i grupy wygaszające (Dnp) do zastosowań FRET lub etykiety powinowactwa (biotyna, biotyna-PEG, hydroksyloamina) do biokoniugacji i immobilizacji powierzchniowej.
Wstępnie załadowane żywice są łatwe w użyciu i mogą być ogólnie stosowane w zautomatyzowanym oprzyrządowaniu bez modyfikacji istniejących protokołów syntezy Fmoc. Jedynymi wyjątkami są żywice EDANS NovaTag™ i Universal NovaTag™, w których przyłączenie pierwszej reszty musi być przeprowadzone w zmodyfikowanych warunkach, ponieważ wiąże się to z acylowaniem drugorzędowej aminy (Metoda 2). Po wydłużeniu łańcucha i rozszczepieniu za pomocą TFA w zwykły sposób, otrzymuje się produkty zawierające odpowiedni fluorofor lub biotynę na C-końcu.
Użycie wstępnie załadowanych żywic pozwala uniknąć nieodłącznych problemów związanych ze słabą rozpuszczalnością i nieefektywnym sprzęganiem, a także dodatkowych etapów i kosztów, które są związane z wprowadzeniem biotyny i niektórych fluoroforów w syntezie w fazie stałej. Podejście to jest szczególnie odpowiednie do produkcji peptydów do badań przesiewowych o wysokiej przepustowości, ponieważ eliminuje trudności związane z zapewnieniem całkowitego włączenia etykiety dla wszystkich cząsteczek w macierzy. Żywice NovaTag™ zawierające różne etykiety i grupy dystansowe mogą być również produkowane na zamówienie.
W sytuacjach, w których nie zawsze jest oczywiste, która etykieta lub kombinacja etykiet jest optymalna dla danego zastosowania, oferujemy uniwersalne żywice NovaTag™. Nośniki te ułatwiają syntezę peptydów zawierających dowolną liczbę różnych ugrupowań acylowych na N- i C-końcu z pojedynczej syntezy w fazie stałej (Rysunek 3). Żywice uniwersalne są również przydatne do przygotowywania znakowanych peptydów zawierających fluorofory, które nie są kompatybilne z protokołami Fmoc SPPS, takimi jak TAMRA i FAM4, ponieważ pozwalają na łatwe wprowadzenie etykiet jako ostatni etap przed rozszczepieniem. Uniwersalna żywica PEG NovaTag™ jest szczególnie skuteczna w zastosowaniach, w których wymagana jest hydrofilowa przekładka między peptydem a etykietą i gdzie rozpuszczalność peptydu jest problemem.
Po załadowaniu (Metoda 2) pierwszego aminokwasu do związanej z żywicą aminy drugorzędowej, przedłużenie łańcucha przeprowadza się standardowymi metodami Fmoc. Po syntezie żywica może zostać podzielona, a każda podwielokrotność zakończona odpowiednią etykietą funkcjonalizowaną karboksylowo. Zawieszona grupa Mmt jest następnie usuwana przy użyciu HOBt/TFE/DCM (metoda 1), a C-końcowa etykieta jest wprowadzana do każdej podwielokrotności żywicy. W ten sposób z pojedynczej syntezy można przygotować dowolną liczbę wariantów etykiet dla danej sekwencji.
Uniwersalna żywica PEG NovaTag™ została wykorzystana do przygotowania fluorescencyjnie znakowanych peptydów wiążących domenę Shc Src homology 2 połączonych z sekwencjami penetrującymi komórki za pośrednictwem przekładki PEG5 oraz dimerycznych peptydów SMAC połączonych z PEG6.Uniwersalna żywica NovaTag™ została wykorzystana do przygotowania peptydów C-końcowo zmodyfikowanych do ketonu w celu ligacji7.
Metoda 1: Usuwanie grupy Mmt
- Dodaj 0.6 M HOBt w DCM/TFE (1:1) do żywicy spęcznionej w DCM.
- Delikatnie mieszaj przez 1h; roztwór staje się ciemnoczerwony.
- Rozpuszczalnik jest usuwany przez filtrację, a kroki 1 & 2 są powtarzane.
- Żywica jest usuwana przez filtrację, przemywana DMF i używana natychmiast w syntezie, lub przemywana dalej DCM, a następnie MeOH, suszona i przechowywana do późniejszego użycia.
Odczynniki do wprowadzania etykiet optycznych
AMC
Substraty enzymatyczne oparte na fluoroforze 7-amino-4-metylokumaryny (AMC) są bardzo popularnymi narzędziami do badania aktywności i specyficzności proteaz8. W takich substratach AMC jest zazwyczaj połączony z peptydem poprzez utworzenie wiązania amidowego między aminą kumarynową a grupą karboksylową C-końcowej reszty aminokwasowej (Rysunek 4). Proteoliza tego wiązania amidowego uwalnia wolny AMC, powodując duży wzrost fluorescencji, który można wykryć przy 441 nm po wzbudzeniu przy 342 nm.
Rysunek 4.Zasada działania substratów fluorogenicznych znakowanych AMC.
Synteza pochodnych peptyd-AMC jest szczególnie problematyczna ze względu na słabą nukleofilowość grupy aminowej AMC. Zwykła strategia obejmuje najpierw utworzenie pochodnej AMC C-końcowej reszty aminokwasowej, a następnie kondensację fragmentu lub stopniowe wydłużanie. Podejście to nie jest oczywiście odpowiednie dla metod w fazie stałej i nie może być stosowane do produkcji bibliotek substratów enzymatycznych do profilowania proteaz. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, wprowadziliśmy wstępnie załadowane pochodne aminokwasów-AMC: Fmoc-Asp(żywica Wanga)-AMC; Fmoc-Lys(karbaminian żywicy Wanga)-AMC. Kwas asparaginowy i lizyna zostały wybrane, ponieważ aminokwasy te występują w pozycji P1 endogennych substratów dla kilku ważnych proteaz.
Żywice te są niezwykle proste w użyciu i są w pełni kompatybilne ze standardowymi protokołami Fmoc SPPS. Wolna grupa aminowa może być acylowana aminokwasami Fmoc aktywowanymi za pomocą PyBOP® lub TBTU. Po złożeniu peptydu, rozszczepienie 95% TFA uwalnia peptyd-AMC bezpośrednio ze stałego nośnika bez żadnych dodatkowych etapów.
Rysunek 5.Synteza Ac-Asp-Glu-Val-Asp-AMC przy użyciu Fmoc-Asp(żywica Wang)-AMC
7-metoksykumaryna (Mca)
Grupa 7-metoksykumaryny (Mca) fluoryzuje przy długości fali 393 nm, gdy jest stymulowana przy 328 nm, i jest najczęściej stosowana w połączeniu z 2,4-dinitrofenylowymi (Dnp) grupami wygaszającymi9. Może być sprzężony w fazie stałej z wolnymi aminami przy użyciu Mca-OSu, Mca-OHlub włączony podczas przedłużania łańcucha przy użyciu wstępnie uformowanego bloku budulcowego, takiego jak Fmoc-Lys(Mca)-OH10. Fmoc-Lys(Mca)-OH i Mca-OH mogą być sprzęgane przy użyciu dowolnej standardowej metody sprzęgania, takiej jak PyBOP®/DIPEA i DIPCDI/HOBt, podczas gdy wstępnie aktywowana pochodna, Mca-OSu, sprzęga się najlepiej w DMSO lub NMP w obecności HOBt. Cząsteczka kumaryny jest stabilna w standardowych warunkach stosowanych w Fmoc SPPS.
Żywica Mca NovaTag™ dostarcza peptydy C-końcowo zmodyfikowane fluoroforem Mca przyłączonym za pomocą przekładki etylenodiaminy1-3. Po usunięciu grupy Fmoc, związaną z żywicą aminę pierwszorzędową można obciążyć pierwszą resztą aminokwasową przy użyciu standardowych metod aktywacji, takich jak PyBOP, HOBt/DIPCDI. Po złożeniu peptydu, traktowanie 95% TFA rozszczepia peptyd Mca bezpośrednio z żywicy.
Dabcyl
Dabcyl jest jedną z najczęściej stosowanych grup wygaszających ze względu na brak wrodzonej fluorescencji i spektralne nakładanie się (λmax 453 nm) z wieloma powszechnie stosowanymi fluoroforami, takimi jak EDANS, Mca, TET, JOE, FAM. W przygotowaniu substratów peptydowych wygaszanych fluorescencyjnie, jest on najczęściej stosowany w połączeniu z EDANS, ponieważ to połączenie jest szczególnie skuteczne ze względu na ich doskonałe nakładanie się widm11,12.
Grupę Dabcyl najwygodniej jest wprowadzić podczas syntezy substratu w fazie stałej. Dodanie do N-końcowej grupy aminowej najlepiej osiągnąć stosując Dabcyl-OSu w DMSO lub NMP w obecności HOBt. Gdy grupa Dabcyl ma być zlokalizowana w łańcuchu peptydowym, najprostszym podejściem jest wprowadzenie Lys(Dabcyl) w pożądanym położeniu przy użyciu Fmoc-Lys(Dabcyl)-OH aktywowanego PyBOP®/DIPEA.
2,4-Dinitrofenyl (Dnp)
Grupa Dnp (λmax 348 nm) jest preferowaną grupą wygaszającą dla fluoroforu Mca9. Najłatwiej jest ją włączyć do peptydu jako Fmoc-Lys(Dnp)-OH, który może być sprzężony przy użyciu dowolnej standardowej metody aktywacji.
Żywica ta jest idealna do montażu znakowanych peptydów zawierających C-końcową grupę Dnp1-3. Po usunięciu grupy Fmoc, związaną z żywicą aminę pierwszorzędową można obciążyć pierwszą resztą aminokwasową przy użyciu standardowych metod aktywacji, takich jak PyBOP®, HOBt/DIPCDI. Po złożeniu peptydu, traktowanie 95% TFA rozszczepia peptyd Dnp bezpośrednio z żywicy. Żywica ta jest szczególnie korzystna do syntezy peptydów FRET, ponieważ obecność wygaszacza w każdym łańcuchu peptydowym minimalizuje poziomy fluorescencyjnych niewygaszonych produktów ubocznych, a tym samym zmniejsza fluorescencję tła substratów FRET produktu.
EDANS
Fmoc-Asp(EDANS)-OH. oraz Fmoc-Glu(EDANS)-OH
.Para fluorofor-wygaszacz EDANS/Dabcyl jest jedną z najczęściej stosowanych w aplikacjach FRET, ze względu na doskonałe nakładanie się widma emisji EDANS (λex 341 nm, λem 471 nm) i widmem absorbancji Dabcyl (λmax 453 nm)9,10 (Rys. 6). Wygaszanie fluorescencji EDANS przez Dabcyl jest w konsekwencji wysoce wydajne, z nawet 40-krotnym wzrostem fluorescencji zaobserwowanym po proteolizie peptydów znakowanych Dabcylem/EDANS13.
Rysunek 6.Widma absorbancji i emisji dabcylu i EDANS
W celu włączenia EDANS do łańcucha peptydowego, najprostszym podejściem jest użycie Fmoc-Asp(EDANS)-OH lub Fmoc-Glu(EDANS)-OH podczas montażu peptydu13,14. Wprowadzenie tych pochodnych podczas SPPS można osiągnąć stosując aktywację PyBOP®/DIPEA w połączeniu z wydłużonym czasem sprzęgania14. Należy unikać silnych odczynników acylujących, takich jak PyBrOP, ponieważ ich użycie może prowadzić do acylowania azotu naftyloaminy.
Rysunek 7.Załadowana żywica EDANS NovaTag™ pokazująca punkt przyłączenia peptydu i miejsce rozszczepienia.
Tradycyjnie, wprowadzenie ugrupowania EDANS na C-końcu peptydu uzyskuje się poprzez sprzężenie fragmentu peptydu z EDANS w roztworze15. Żywica EDANS NovaTag™ firmy Novabiochem® umożliwia po raz pierwszy bezpośrednią syntezę peptydów znakowanych EDANS na C-końcu peptydu metodą syntezy w fazie stałej2 (Rysunek 7). Ponieważ fluorofor EDANS jest wbudowany w łącznik, zostaje on połączony z C-końcem peptydu, gdy pierwszy aminokwas jest przyłączony do żywicy. Grupa wygaszająca Dabcyl może być wprowadzona do N-końca przy użyciu Dabcyl-OSu w DMSO lub DMF w obecności HOBt. Jeśli grupa Dabcyl ma być zlokalizowana w łańcuchu peptydowym, najprostszym podejściem jest wprowadzenie Lys(Dabcyl) w pożądanej pozycji przy użyciu Fmoc-Lys(Dabcyl)-OH aktywowanego za pomocą PyBOP®/DIPEA.
Pierwszym i najważniejszym krokiem w stosowaniu żywicy EDANS NovaTag™ jest przyłączenie pierwszej reszty aminokwasowej. Ponieważ proces ten obejmuje acylowanie związanej z żywicą aminy drugorzędowej, najlepiej przeprowadzić go przy użyciu aktywacji HATU (Metoda 2). Można również zastosować estry Pfp w obecności kolidyny, chociaż mogą być wymagane dłuższe czasy acylowania. Ważne jest, aby reakcja ta została przeprowadzona do końca, ponieważ wszelkie nieprzereagowane grupy aminowe pozostawione na żywicy mogą reagować w kolejnych sprzężeniach i prowadzić do tworzenia skróconych sekwencji. Po załadowaniu, substytucja żywicy powinna być sprawdzona za pomocą testu Fmoc UV, a jeśli to konieczne, reakcja ładowania powinna być powtórzona przy użyciu świeżych odczynników. Po załadowaniu pierwszego aminokwasu można przeprowadzić syntezę peptydu w standardowych warunkach. Należy unikać stosowania PyBroP® ponieważ może to prowadzić do podwójnej acylacji. Rozszczepienie żywicy można przeprowadzić przy użyciu standardowych koktajli TFA; jednak ze względu na bliskość azotu naftyloaminy do miejsca rozszczepienia łącznika, uwalnianie produktu może być czasami powolne. Reakcję można przyspieszyć, jeśli to konieczne, dodając kilka kropli TMSBr do standardowego koktajlu TFA, pod warunkiem pominięcia wody.
Żywica EDANS NovaTag™ została ostatnio wykorzystana do przygotowania fluorescencyjnie znakowanych sond powinowactwa aminoalkanodifenylofosfonianu dla proteaz serynowych podobnych do chymotrypsyny i elastazy16.
Metoda 2: Ładowanie żywic EDANS/Universal/Biotin-PEG NovaTag™
- Zawiesić żywicę w DMF i pozostawić do spęcznienia na 30 min. (W przypadku żywicy Universal/Biotin-PEG NovaTag™ grupa Fmoc powinna być usunięta na tym etapie za pomocą 20% piperydyny w DMF.)
- Rozpuścić Fmoc-aminokwas (2,5 eq.) i HATU (2,5 eq.) w minimalnej objętości DMF i dodać do żywicy. Dodać DIPEA (5 eq.) i wymieszać.
- Mieszaninę pozostawia się na 2 godziny z delikatnym mieszaniem. Próbkę żywicy można usunąć, a obciążenie określić za pomocą testu Fmoc UV [Metoda 11: Oszacowanie poziomu przyłączenia pierwszej reszty]. W razie potrzeby powtórzyć sprzęganie ze świeżymi odczynnikami.
- Żywicę usuwa się przez filtrację, przemywa DMF i natychmiast wykorzystuje w syntezie lub przemywa dalej DCM, a następnie MeOH, suszy i przechowuje do późniejszego wykorzystania.
Żywica ta ułatwia bezpośrednią syntezę peptydów C-końcowo znakowanych grupą dandylową (λex 335 nm, λem 526 nm). Po usunięciu grupy Fmoc, związaną z żywicą aminę pierwszorzędową można obciążyć pierwszą resztą aminokwasową przy użyciu standardowych metod aktywacji, takich jak PyBOP®, HOBt/DIPCDI. Po złożeniu peptydu, traktowanie 95% TFA rozszczepia peptyd Dansyl bezpośrednio z żywicy.
Żywica Dansyl NovaTag™ została wykorzystana do przygotowania sond FRET dla białka wiążącego rtęć MerP17 i sfunkcjonalizowanych fibryli amyloidowych18.
Novabiochem® dostarcza karboksyfluoresceinę (FAM; λex 494 nm, λem 518 nm) i karboksytetrametylorodaminę (TAMRA, λex 555 nm; λem 580 nm) jako pojedyncze izomery, zapewniając znakowane produkty o określonej strukturze chemicznej, a także znacznie ułatwiając oczyszczanie i charakteryzację produktu. Jednakże, dla tych zastosowań, które nie wymagają pojedynczego izomeru barwnika, 5,6-karboksyfluoresceina jest również dostępna jako opłacalna opcja.
Barwniki są najwygodniej wprowadzane podczas syntezy w fazie stałej poprzez sprzęganie z N-końcowymi lub bocznymi grupami aminowymi przy użyciu HOBt lub HOAt/DIPCDI w DMF (Metoda 3). Gdy jeden z barwników ma być umieszczony na bocznej grupie aminowej, najprostszym podejściem jest włączenie ortogonalnie chronionej pochodnej, takiej jak Lys(Mtt) lub Lys(ivDde), która może być później selektywnie deprotekowana na żywicy bezpośrednio przed sprzężeniem barwnika. Po dodaniu FAM i kolejnych aminokwasów, żywicę należy przemyć 20% piperydyną w DMF w celu usunięcia estrów fenylowych utworzonych przez acylowanie fenolowych hydroksyli FAM. Traktowanie peptydów FAM hydrazyną może prowadzić do tworzenia hydrazonu. Estrów i tworzenia hydrazonu można uniknąć, jeśli po wprowadzeniu FAM i późniejszej obróbce piperydyną, fenolowe hydroksyle zostaną zablokowane przez tritylowanie Trt-Cl i DIPEA w DCM2. TAMRA i FAM mogą być również dodawane przy użyciu wstępnie uformowanych estrów OSu.
Gdy są stosowane razem w tym samym peptydzie, transfer energii rezonansu fluorescencji (FRET) między FAM i TAMRA powoduje wygaszenie fluorescencji obu barwników, co czyni je doskonałymi odczynnikami do zastosowań FRET19.
Metoda 3: Sprzęganie barwników funkcjonalizowanych karboksylowo
- Rozpuścić barwnik (1.5 eq.) w minimalnej ilości DMF z HOBt lub HOAt (1.5 eq.). Jeśli to konieczne, dodać DMSO w celu ułatwienia rozpuszczania.
- Dodać DIPCDI (1,7 eq.) i mieszać mieszaninę i odstawić na 10 min.
- Dodać mieszaninę odsączonej żywicy peptydylowej i delikatnie mieszać przez 2 h. Sprawdzić wolne grupy aminowe za pomocą testu Kaisera. Uwaga: test TNBS nie działa w przypadku kulek zawierających kolorowe barwniki. Jeśli reakcja nie jest kompletna, pozostawić bezczynnie, a następnie ponownie sprawdzić. Jeśli po tym czasie reakcja nadal nie jest zakończona, przepłucz żywicę i powtórz ją ze świeżymi odczynnikami.
Barwniki Atto
Barwniki Atto to seria barwników fluorescencyjnych, które spełniają krytyczne potrzeby nowoczesnych technologii fluorescencyjnych:
- Stabilność - Atto 655 i Atto 647N są fotostabilne i wysoce odporne na degradację ozonową, co czyni je idealnymi do zastosowań w mikromacierzach.
- Długie czasy życia sygnału - Czasy zaniku sygnału od 0,6 do 4,1 nanosekund pozwalają na badania czasowe w celu zmniejszenia tła autofluorescencji i rozpraszania.
- Redukcja tła - Kilka barwników Atto ma długość fali wzbudzenia większą niż 600 nm, redukując fluorescencję tła z próbek, rozpraszanie Rayleigha i Ramana.
- Wybór - Barwniki Atto mają silne sygnały fluorescencyjne, które obejmują widzialne i bliskie podczerwieni długości fal emisji.
Wiele barwników Atto (Atto 590 i powyżej) może być wzbudzanych przy użyciu długości fal większych niż 600 nm. Zastosowanie aktywowanych barwników Atto o długiej długości fali w połączeniu z odpowiednią długością fali wzbudzenia zmniejsza autofluorescencję spowodowaną próbką, rozpuszczalnikiem, szkłem lub polimerem i poprawia ogólną czułość w analizie biologicznej i technikach obrazowania. Fluorescencja tła spowodowana rozpraszaniem Rayleigha i Ramana jest również znacznie zmniejszona dzięki zastosowaniu wzbudzenia o większej długości fali.
Barwniki Atto charakteryzują się silnymi sygnałami fluorescencyjnymi, a większość z nich ma wartości absorpcji molowej >100,000 i niskie nakładanie się wzbudzenia/emisji, dzięki czemu barwniki Atto są idealne do technik multipleksowych wykorzystujących widzialne i bliskie podczerwieni długości fal emisji. Dzięki maksimom sygnału wzbudzenia w zakresie od 390 do 740 nm i dobrej separacji przesunięcia Stokesa, barwniki Atto nadają się do stosowania z dowolnym popularnym źródłem światła wzbudzającego.
Referencje
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?