Rozwiązanie problemu tworzenia aspartymidu w Fmoc SPPS za pomocą Fmoc-Asp(OBno)-OH

Tworzenie aspartymidów^1,2 jest spowodowane powtarzającą się ekspozycją sekwencji zawierających kwas asparaginowy na zasady takie jak piperydyna i może ostatecznie skutkować wytworzeniem 9 różnych produktów ubocznych (Rysunek 1)^3-8. Podczas gdy w wielu przypadkach aspartymidy oraz α- i β-piperydyny powstałe w wyniku tej reakcji ubocznej można łatwo oddzielić od peptydu docelowego za pomocą HPLC, peptydy β-asparaginowe i epimeryzowany peptyd α-asparaginowy są prawie niemożliwe do usunięcia, ponieważ często mają one ten sam czas retencji co peptyd docelowy. Ponadto, ponieważ mają one taką samą masę jak cel, obecność tych produktów ubocznych jest trudna do wykrycia. Tworzenie się aspartymidów jest zatem szczególnie poważnym zagadnieniem w produkcji API opartych na peptydach.

Fmoc-Asp(OBno)-OH 1 to unikalny blok budulcowy opracowany przez naukowców Novabiochem^® który zapewnia proste i uniwersalne rozwiązanie zapobiegające tworzeniu się aspartymidów^9,10 w standardowym Fmoc SPPS.

Rysunek 1. Tworzenie aspartymidu, pokazujące potencjalne produkty uboczne.

Niemal brak tworzenia się aspartymidów, nawet w przypadku sekwencji zawierających Asp-Gly

W testach porównawczych z Fmoc-Asp(OtBu)-OH i Fmoc-Asp(OMpe)-OH, przy użyciu klasycznego peptydu toksyny skorpiona II (VKDXYI, gdzie X=G, N lub R)¹¹ gdzie peptydy związane z żywicą są traktowane 20% piperydyną w DMF przez 200 min w celu symulacji 100 x 2 min cykli deprotekcji, Fmoc-Asp(OBno)-OH dał zdecydowanie najlepsze wyniki. W przypadku X=N i R, zmniejszyło to tworzenie aspartymidu do prawie niewykrywalnych ilości (Rysunek 2, 3, Tabela 1). W przypadku X=G, najtrudniejszej sytuacji, tworzenie aspartymidu zostało zredukowane do zaledwie 0,1%/cykl, co jest nieistotne, jeśli weźmie się pod uwagę, że mieści się to w granicach czystości dostępnych na rynku aminokwasów N-α-Fmoc (Rysunek 4, Tabela 1).

Zwiększona stabilność chiralna

Aspartymidy są chiralnie labilne⁷, co znajduje odzwierciedlenie w wysokich wartościach D-asparaginianu obserwowanych dla peptydów toksyny skorpiona II przygotowanych z Asp(OtBu) i Asp(OMpe) (Tabela 1). Peptydy D-asparaginowe są często ukrytymi zanieczyszczeniami oczyszczonych peptydów ze względu na ich identyczną masę cząsteczkową i prawie identyczne właściwości fizykochemiczne. Niskie wartości D-Asp uzyskane za pomocą Fmoc-Asp(OBno)-OH zdecydowanie sugerują jego zastosowanie w procesach wytwarzania peptydów.

Łatwe sprzęganie i brak produktów alkilacji

Standardowy Fmoc SPPS (Gly²)-GLP-2, 33-mer, przy użyciu Fmoc-Asp(OBno)-OH dostarczył surowca, który zawierał znikome zanieczyszczenia związane z aspartymidem, zwiększając zawartość docelowego peptydu o 25% w porównaniu do standardowej pochodnej Fmoc-Asp(OtBu)-OH (Rysunek 5). Zastosowano pojedyncze jednogodzinne sprzężenia dla dwóch Fmoc-Asp(Bno)-OH. Wysoka czystość produktu wskazywała na łatwość sprzęgania Fmoc-Asp(OBno)-OH, a jego użycie nie prowadziło do tworzenia żadnych produktów ubocznych alkilacji związanych z Bno podczas rozszczepiania za pośrednictwem TFA.

Tabela 1. Skład surowych produktów otrzymanych z żywic peptydylowych VKDXYI po traktowaniu 20% piperydyną w DMF w temperaturze pokojowej. ^a Obliczenie rozpadu na cykl k: rozpad pierwszego rzędu: N = N₀ - e^-kt → k = -ln(N)/t ; N₀ = 1; t = liczba cykli (100); N = powierzchnia % docelowego peptydu.

Asp(OR)-(X) R = X =	Warunki	D-Asp	Aspartimide Per Cykl 10 min [%]a
tBu Arg	Piperydyna w RT	25	1.24
Mpe Arg	Piperidine at RT	11	0.4
Bno Arg	Piperidine at RT	1.1	0.06
tBu Asn	Piperydyna w RT	9,1	1.65
Mpe Asn	Piperydyna w RT	4.2	0.49
Bno Asn	Piperidine at RT	0.9	0.04
tBu Gly	Piperidine at RT	18	0.49
Mpe Gly	Piperidine at RT	6	0.19
Bno Gly	Piperidine at RT	1.4	0.14

Rysunek 2. Profile UPLC surowych rozszczepionych peptydów VKDNYI po traktowaniu 20% piperydyną w DMF przez 18 h. 1: produkt; 2: D/L aspartymidy; 3: D/L piperydydy. A: wykonane z Fmoc-Asp(OtBu)-OH; B: wykonane z Fmoc-Asp(OMpe)-OH; C: wykonane z Fmoc-Asp(OBno)-OH.

Rysunek 3. Profile UPLC surowych rozszczepionych peptydów VKDRYI po traktowaniu 20% piperydyną w DMF przez 18 h. 1: produkt; 2: D/L aspartymidy; 3: D/L piperydydy. A: wykonane z Fmoc-Asp(OtBu)-OH; B: wykonane z Fmoc-Asp(OMpe)-OH; C: wykonane z Fmoc-Asp(OBno)-OH.

Rysunek 4. Profile UPLC surowych rozszczepionych peptydów VKDGYI po traktowaniu 20% piperydyną w DMF przez 18 h. 1: produkt; 2: D/L aspartymidy; 3: D/L piperydydy. A: wykonane z Fmoc-Asp(OtBu)-OH; B: wykonane z Fmoc-Asp(OMpe)-OH; C: wykonane z Fmoc-Asp(OBno)-OH.

Rysunek 5. Profile UPLC surowego rozszczepionego Gly-GLP-2 wykonane z A, Fmoc-Asp(OtBu)-OH i B, Fmoc-Asp(OBno)-OH. A: D/L aspartimidy; B: D/L-α/β-piperydydy.

Referencje

1. Barany G, Merrifield RB. in The peptides, Vol. 2, E. Gross & J. Meienhofer (Eds), Academic Press, New York, 1979, pp. .1-234..

2. Bodansky M, Martinez J. (1978). in The peptides, Vol. 5, E. Gross & J. Meienhofer (Eds), Academic Press, New York, 1983, pp. 111-216..

3. Nicolás E, Pedroso E, Girald E. 1989. Formation of aspartimide peptides in Asp-Gly sequences. Tetrahedron Letters. 30(4):497-500. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(00)95238-9

4. Dölling R. et al. (1994) J. Chem. Soc., Chem. Commun., 853.

5. Yang Y, Sweeney WV, Schneider K, Thörnqvist S, Chait BT, Tam JP. 1994. Aspartimide formation in base-driven 9-fluorenylmethoxycarbonyl chemistry. Tetrahedron Letters. 35(52):9689-9692. https://doi.org/10.1016/0040-4039(94)88360-2

6. Lauer JL, Fields CG, Fields GB. 1995. Sequence dependence of aspartimide formation during 9-fluorenylmethoxycarbonyl solid-phase peptide synthesis. Lett Pept Sci. 1(4):197-205. https://doi.org/10.1007/bf00117955

7. I. Schön, et al. (1991) J. Chem. Soc., Chem. Commun., 3213..

8. Orpiszewski J, Schormann N, Kluve-Beckerman B, Liepnieks JJ, Benson MD. 2000. Protein aging hypothesis of Alzheimer disease. FASEB j.. 14(9):1255-1263. https://doi.org/10.1096/fasebj.14.9.1255

9. Behrendt R, Huber S, Martí R, White P. 2015. New t-butyl based aspartate protecting groups preventing aspartimide formation in Fmoc SPPS. J. Pept. Sci.. 21(8):680-687. https://doi.org/10.1002/psc.2790

10. Behrendt R, Huber S, White P. 2016. Preventing aspartimide formation in Fmoc SPPS of Asp-Gly containing peptides - practical aspects of new trialkylcarbinol based protecting groups. J. Pept. Sci.. 22(2):92-97. https://doi.org/10.1002/psc.2844

11. Mergler M, Dick F, Sax B, Weiler P, Vorherr T. 2003. The aspartimide problem in Fmoc-based SPPS. Part I. J. Peptide Sci.. 9(1):36-46. https://doi.org/10.1002/psc.430