HumanKine^® Termostabilny bFGF

Nick Asbrock, Christine Chen, Vi Chu

MilliporeSigma, Temecula, CA, USA

Wprowadzenie

Fibroblast growth factors (FGFs) są wydzielanymi glikoproteinami, które regulują kilka podstawowych szlaków rozwojowych i pomagają regulować patterning mezodermy i ektodermy we wczesnym rozwoju embrionalnym. U osób dorosłych FGF uczestniczą w kilku procesach fizjologicznych i patologicznych, w tym w proliferacji komórek, ich przeżyciu, różnicowaniu, gojeniu ran i regulacji angiogenezy. Proces sygnalizacji FGF obejmuje ich wiązanie z receptorami FGF (FGFR) na powierzchni komórek. Zidentyfikowano 23 różne FGF, które wywierają swoje działanie poprzez cztery główne typy FGFR związanych z kinazą tyrozynową, które oznaczono jako FGFR1, FGFR2, FGFR3 i FGFR4. Po związaniu ligandu receptory te ulegają dimeryzacji, co skutkuje aktywacją ich domen kinazy tyrozynowej i międzycząsteczkową transfosforylacją.

Podstawowy FGF, znany również jako bFGF lub FGF-2, należy do grupy strukturalnie homologicznych FGF, które charakteryzują się wiązaniem heparyny i aktywnością mitogenną na różnych komórkach pochodzenia mezodermalnego i neuroektodermalnego. Zastosowanie bFGF w biologii komórek macierzystych jest powszechne i jest krytycznym czynnikiem wzrostu, który umożliwia ekspansję wielu komórek macierzystych w ich stanach pluripotencjalnych lub multipotencjalnych. Kilka ostatnich badań sugeruje istotną rolę sygnalizacji FGF/kinazy regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym (Erk) w promowaniu przejścia ze stanu naiwnego do zagruntowanego stanu różnicowania oraz w zapobieganiu powrotowi zagruntowanych komórek do stanu naiwnego. Sygnalizacja FGF w efekcie stabilizuje stan primed ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. Ze względu na jego szybką degradację w temperaturze 37 °C, wielu badaczy komórek macierzystych dodaje wysokie poziomy bFGF do swoich pożywek i wymaga uciążliwej, częstej wymiany pożywek.

HumanKine^® Thermostable bFGF to zmodyfikowana rekombinowana wersja ludzkiego bFGF. Jest on generowany poprzez selektywną zmianę sekwencji aminokwasów w celu zwiększenia jego termostabilności w porównaniu do bFGF typu dzikiego. To humanizowane rekombinowane białko jest wytwarzane przy użyciu zastrzeżonego systemu ekspresji ludzkich komórek i jest oznaczone jako produkt wolny od kseno. Wykazaliśmy, że to unikalne białko ma zwiększoną stabilność w temperaturze 37 °C, jednocześnie posiadając zwiększoną funkcjonalność biologiczną zarówno na ludzkich komórkach iPS, jak i populacjach ludzkich nerwowych komórek macierzystych. Zastosowanie tego produktu zmniejszy zmienność powszechnie obserwowaną w wielu hodowlach komórek macierzystych oraz skróci czas i koszty potrzebne do hodowli tych wymagających komórek.

Rysunek 1. Szlaki sygnałowe FGF prowadzą do przeżycia komórek, proliferacji, inwazji i migracji.

Metody

Określanie stabilności cytokin bFGF w podwyższonych temperaturach

Stabilność normalnych i HumanKine^® termostabilnych białek rekombinowanych bFGF analizowano w temperaturze 37 °C przez okres 7 dni. Normalny bFGF lub HumanKine^® Thermostable bFGF rozcieńczono w 20% pożywce KOSR do końcowego stężenia 150 ng/ml. Próbki pozostawiono w temperaturze 37 °C na okres jednego tygodnia z zatrzymaniem w różnych punktach czasowych w tym okresie. Poziom pozostałego bFGF określano ilościowo w każdym punkcie czasowym przy użyciu ilościowego zestawu ELISA bFGF.

Hodowla ludzkich komórek iPS

Ludzkie komórki iPS zostały wygenerowane z noworodkowych ludzkich fibroblastów napletka przy użyciu zestawu do przeprogramowania lentiwirusowego STEMCCA™, a następnie wycięcia transgenów przy użyciu przepuszczalnej dla komórek Cre-Recombinase. Wolne od transgenów komórki iPS utrzymywano w pożywce KOSR ze standardowym bFGF (10 ng/ml) na pierwotnych mysich fibroblastach embrionalnych przez 20 pasaży przy użyciu ręcznej techniki pasażowania, aż do wykorzystania w eksperymentach. Przy 21 przejściu, ludzkie komórki iPS zostały ręcznie przeniesione do pożywki KOSR bez FGF, KOSR + normalny bFGF (10 ng/ml) lub pożywki KOSR + termostabilny bFGF (10 ng/ml) w duplikatach po około 50 kolonii/basenik z obecnymi komórkami zasilającymi. Komórki karmiono co trzeci dzień przez jeden pasaż w powyższych warunkach, a następnie utrwalano i poddawano działaniu anty-Oct-4 i anty-TRA-1-60 w celu immunobarwienia. Całkowita liczba zróżnicowanych kolonii została policzona ręcznie w dniu 7.

Expansion of ENStem™-A human neural progenitors

Komórki ENStem™-A w pasażu 20 rozmrożono na płytkach pokrytych matrycą Matrigel (1:50) w pożywce do ekspansji neuronalnej ENStem™-A ze standardowym bFGF (20 ng/ml) lub HumanKine^® Thermostable bFGF (20 ng/ml). Komórki pasażowano przy użyciu odczynnika Accutase™, a po osiągnięciu 80% konfluencji w trzech pasażach, poddano je immunobarwieniu markerami neuronalnych komórek macierzystych anty-nestyna i anty-Sox-2.

W celu oceny proliferacji, 5x10⁴ komórek wysiano na 6-dołkowe płytki pokryte matrycą Matrigel (1:50) w dwóch powtórzeniach w pożywce do ekspansji neuronalnej ENStem™-A + standardowy bFGF (20 ng/ml) lub pożywce do ekspansji neuronalnej ENStem™-A + termostabilny bFGF (20 ng/ml). Komórki hodowano przez 6 dni bez wymiany pożywki. Komórki odłączono, a potrójne próbki zmieszano z błękitem Trypana i policzono za pomocą hemocytometru w dniach 2, 4 i 6.

Wyniki

Eksperymenty termostabilności

Badaliśmy stabilność termiczną normalnego bFGF i zmodyfikowanego, termostabilnego bFGF w temperaturze 37 °C przez okres siedmiu dni (Rysunek 2). Obniżenie poziomu normalnego bFGF było bardziej wyraźne (prawie 95% redukcji w dniu 1) w porównaniu do termostabilnego bFGF (tylko ~60% redukcji w dniu 1). Oba bFGF wykazywały stopniowy spadek w okresie 7 dni; jednak przy wolniejszym tempie spadku z termostabilnym bFGF.

Rysunek 2. Zwiększona stabilność termostabilnego bFGF w 37 °C w porównaniu z normalnym bFGF.

Eksperymenty z ludzkimi komórkami iPS

Kiedy zastosowaliśmy ograniczony harmonogram karmienia do hodowli ludzkich komórek iPS i użyliśmy termostabilnego bFGF, zaobserwowaliśmy podwyższone poziomy markerów pluripotencji Oct-4 i TRA-1-60 po 7 dniach i znaczące zmniejszenie spontanicznego różnicowania ludzkich komórek iPS w porównaniu do sytuacji, gdy użyliśmy normalnego bFGF w tym samym harmonogramie karmienia (Ryc. 3 i 4). W rzeczywistości nie stwierdziliśmy znaczącego zmniejszenia liczby spontanicznie zróżnicowanych kolonii podczas stosowania normalnego bFGF w porównaniu z samą pożywką KOSR (Rysunek 4).

Rysunek 3. Termostabilny bFGF wspomaga pluripotencjalny wzrost ludzkich komórek iPS przy użyciu reżimu karmienia co trzy dni.

Ludzkie komórki iPS hodowane w pożywce HumanKine^® Thermostable bFGF po ograniczonym schemacie żywienia wykazują podwyższony poziom markerów pluripotencji Oct-4 (zielony) i TRA-1-60 (czerwony) po 7 dniach. Ludzkie komórki IPS hodowane na pożywce KOSR z normalnym bFGF po ograniczonym schemacie żywienia spontanicznie różnicują się w centrum kolonii i nie wyrażają tych samych jednolitych poziomów ekspresji Oct-4 i TRA-1-60.

Rysunek 4. Ludzkie komórki iPS wykazują niższe poziomy spontanicznego różnicowania przy zastosowaniu schematu karmienia co trzy dni w połączeniu z HumanKine® Thermostable bFGF.

Eksperymenty z ludzkimi neuralnymi komórkami macierzystymi ENStem™-A

Aby ustalić, czy termostabilny bFGF może również ułatwić hodowlę neuralnych komórek progenitorowych, najpierw hodowaliśmy je z termostabilnym bFGF przy użyciu normalnego harmonogramu karmienia (Rysunek 5). Immunocytochemia i mikroskopia jasnego pola wykazały, że komórki po trzech pasażach wykazywały prawidłową morfologię i ekspresję markerów neuronalnych komórek macierzystych Sox-2 i nestyny.

Rysunek 5. Neuronalne komórki progenitorowe ENStem™-A hodowane przez 3 pasaże w HumanKine® Thermostable bFGF zgodnie z normalnym schematem żywienia wykazują prawidłową morfologię i wyrażają markery neuronalnych komórek macierzystych Sox-2 i Nestin. Komórki wybarwione nestyną zostały wybarwione przeciwbarwnikiem jądrowym DAPI (niebieskim).

Następnie zmierzyliśmy proliferację neuronalnych komórek progenitorowych, utrzymując je w minimalnym harmonogramie karmienia, w którym komórki były inkubowane przez sześć dni bez żadnych zmian pożywki. Po sześciu dniach w hodowlach zawierających termostabilny bFGF było nieco więcej komórek na studzienkę w porównaniu z normalnym bFGF (Rysunek 6).

Rysunek 6. Wyższe wskaźniki proliferacji ludzkich neuronalnych komórek progenitorowych ENStem™-A przy zastosowaniu ograniczonego schematu żywienia przy użyciu termostabilnego bFGF w porównaniu z normalnym bFGF. (A) Przebieg czasowy pokazujący liczbę komórek w dniach 2, 4 i 6 inkubacji. (B) Porównanie liczby komórek na studzienkę po sześciu dniach inkubacji bez wymiany pożywki. Eksperymenty przeprowadzono przy użyciu trzech powtórzeń dla każdego punktu czasowego i warunków hodowli.

Dyskusja

Fibroblast growth factor odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu embrionalnych komórek macierzystych i komórek iPS w proliferacyjnym, niezróżnicowanym stanie. Podstawowy FGF jest zwykle dodawany do pożywki hodowlanej w celu podtrzymania fosforylacji ERK i ekspresji Nanog¹. Poziomy bFGF wymagane do podtrzymania pluripotencji przez pewien okres czasu są około 10-krotnie wyższe niż te wymagane dla innych typów komórek². Chen i wsp. wykazali, że kwaśny FGF jest wysoce niestabilny w temperaturze 37 °C i nie utrzymuje fosforylacji ERK i pluripotencji w komórkach macierzystych1. Podobne zjawisko zostało zasugerowane dla bFGF. Jednak ich badania wykazały, że w temperaturze 37 °C bFGF ulega agregacji, zmniejszając w ten sposób jego biologiczną dostępność w celu utrzymania pluripotencji.

Zgodnie z tymi wskazaniami, nasze dane sugerują, że HumanKine^® Thermostable bFGF może być stosowany z ludzkimi ESC, iPS i neuralnymi komórkami macierzystymi w celu utrzymania ich w stanie pluripotencjalnym i multipotencjalnym jako bardziej skuteczna alternatywa dla normalnego bFGF. Ponadto, ze względu na zwiększoną stabilność, termostabilny bFGF pozwala na mniej rygorystyczny harmonogram karmienia, zwiększając elastyczność eksperymentalną tych modeli komórkowych.