HPLC dużych cząsteczek

Biomolekuły to duże, polimeryczne związki chemiczne wytwarzane przez żywe komórki, które służą jako podstawowe elementy budulcowe żywych organizmów i przeprowadzają wiele procesów biologicznych niezbędnych do życia. Główne typy biomolekuł obejmują białka, peptydy, polinukleotydy, węglowodany, lipidy, witaminy i koenzymy. Charakter struktury dużych cząsteczek i biomolekuł, ich różnorodność chemiczna, konieczność uwzględnienia aktywności biologicznej i złożonych matryc wymaga skutecznej techniki charakteryzacji. Chociaż dostępnych jest wiele technik separacji i analizy, najczęściej stosowana jest wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC). Ze względu na ich liczne grupy funkcyjne i wiele konformacji, analiza biomolekuł HPLC opiera się na różnych trybach, takich jak faza odwrócona, wykluczenie wielkości lub wymiana jonowa. Niezależnie od zastosowanych trybów separacji, wydajne upakowanie kolumn i spójny skład chemiczny cząstek fazy stacjonarnej mają kluczowe znaczenie dla dokładnej i niezawodnej separacji biomolekuł.  

• Reversed-Phase Biomolecule HPLC
• chromatografia wykluczania wielkości (SEC)
• chromatografia oddziaływań hydrofobowych (HIC)
• chromatografia jonowymienna (IEX)
• Chromatografia powinowactwa

WYSZUKIWANIE CHROMATOGRAMÓW

Wyszukiwanie chromatogramów

.

Powiązane artykuły techniczne

• Przewodnik rozwiązywania problemów HPLC
  Korygowanie typowych problemów HPLC w celu przywrócenia wydajności kolumny, rozwiązywanie problemów z pikami, czasem retencji, szumem i rozdzielczością chromatogramów.
• Kolumny i standardy analityczne dla Protein SEC
  Kolumny do chromatografii wykluczania (SEC) i gotowe do użycia wzorce ułatwiają opracowywanie metod i zwiększają niezawodność metod SEC dla białek.
• Analityczne kolumny SEC do separacji biomolekuł
  Kolumny do chromatografii wykluczania zwiększają wydajność separacji biomolekuł dzięki cząsteczkom o wielkości poniżej 2 μm, poprawiając wydajność analityczną.
• Separacja biopolimerów
  Oferta produktów Supelco do separacji biopolimerów obejmuje kolumny i nośniki podzielone na kategorie według trybu separacji, a także według marki kolumny.
• HPLC Columns for Antibody and Large Protein Analysis
  BIOshell™ IgG 1000 Å C4 columns are highly suited for the reversed phase separation of high molecular weight compounds such as monoclonal antibodies with molecular weight of 150 kDa.
• Zobacz wszystkie (131)

Powiązane protokoły

• Peptide Mapping LC-MS/MS Analysis Workflow for Adalimumab
  An optimized LC-MS/MS based workflow for low artifact tryptic digestion and peptide mapping of monoclonal antibody, adalimumab (Humira) using filter assisted sample preparation (FASP).
• Released N-Linked Glycan Analysis Workflow of Adalimumab
  A step-by-step protocol for released N-linked glycan analysis of the monoclonal antibody adalimumab, based on UHPLC-FLR-MS and procainamide labeling.
• Protocol for Purification, Optional Reduction, and SEC-MS Analysis of a Monoclonal Antibody
  A complete workflow for the intact and middle-up mass analysis of reduced and non-reduced monoclonal antibodies based on SEC-MS with sample preparation by protein-A affinity clean-up.
• HPLC Analysis of Glycans
  HPLC Analysis of Glycans
• Faster Protein and Peptide Liquid Chromatography (FP2LC)
  Larger porous shell particles with narrow particle size distribution, used in Supelco's BIOshell™ columns for the reversed-phase U/HPLC analysis of peptides and proteins, provide increased efficiency per unit pressure drop.
• Zobacz wszystkie (40)

Znajdź więcej artykułów i protokołów

Wprowadź słowa kluczowe

HPLC z odwróconymi fazami biomolekuł

HPLC z odwróconymi fazami (RP-HPLC) to czuła i wszechstronna technika stosowana do rozdzielania i analizy białek, fragmentów białek i peptydów. RP-HPLC wykorzystuje niepolarną fazę stacjonarną i polarną fazę ruchomą. Retencja białek i peptydów na fazie stacjonarnej odbywa się zgodnie z zasadami adsorpcji i podziału. Hydrofobowe regiony białka odwracalnie przyłączają się do fazy stacjonarnej. Białka są eluowane poprzez zwiększenie niepolarnego charakteru fazy ruchomej. Na rozdzielczość może wpływać wielkość porów, wielkość cząstek, długość kolumny i łańcuch węglowodorowy przyłączony do fazy stacjonarnej.

Chromatografia wykluczania wielkości (SEC)

Chromatografia wykluczania wielkości (SEC) to tryb chromatografii bez denaturacji, który rozdziela cząsteczki według ich wielkości (tj. promienia hydrodynamicznego). Tryb ten nie opiera się na interakcji analitu z fazą stacjonarną, ale raczej na losowym przepływie analitu przez cząsteczki fazy stacjonarnej. Anality o wysokiej masie cząsteczkowej eluują wcześniej, ponieważ są całkowicie lub częściowo wykluczone z porów cząstek fazy stacjonarnej, podczas gdy anality o niższej masie cząsteczkowej eluują później, ponieważ spędzają więcej czasu na pokonywaniu trudnej ścieżki przez cząstkę. SEC został wykorzystany do scharakteryzowania agregatów i fragmentów przeciwciał monoklonalnych (mAbs), oszacowania nieznanych mas cząsteczkowych białek i określenia stabilności preparatów białkowych.

Chromatografia oddziaływań hydrofobowych (HIC)

Chromatografia oddziaływań hydrofobowych (HIC) to tryb chromatografii, który oddziela anality na podstawie stopnia oddziaływania między hydrofobowymi cząsteczkami analitu a hydrofobowymi ligandami fazy stacjonarnej. Ze względu na niższą masę cząsteczkową i mniejszą skłonność do fałdowania, HIC zwykle nie jest stosowana do separacji peptydów. W przypadku wysokich stężeń soli, warstwy hydratacyjne białek mogą zostać zakłócone na tyle, aby hydrofobowe obszary powierzchniowe mogły połączyć się z niepolarną fazą stacjonarną. Wybór soli jest podyktowany serią Hofmeistera, która klasyfikuje kationy i aniony według ich zdolności do zakłócania warstw hydratacyjnych białek (chaotropowe) lub promowania tworzenia warstw hydratacyjnych białek (kosmotropowe). Typowe sole obejmują siarczan amonu, siarczan potasu i siarczan sodu. Chromatografia oddziaływań hydrofobowych jest obecnie wykorzystywana do określania profilu stosunku leku do przeciwciała (DAR) koniugatów przeciwciało-lek (ADC).

Chromatografia jonowymienna (IEX)

Chromatografia jonowymienna (IEX) to sposób chromatografii, który rozdziela anality według ładunku. Białka i peptydy są amfoteryczne, co oznacza, że wykazują zarówno funkcje kwasowe, jak i zasadowe. Kwaśne funkcje białek obejmują kwas asparaginowy, kwas glutaminowy, cysteinę, tyrozynę i α-karboksylan C-końca. Podstawowe funkcje białek obejmują argininę, histydynę, lizynę i α-aminę na N-końcu. Warianty ładunku bioterapeutycznego mogą być wykrywane i rozwiązywane przez IEX. Warianty ładunku mogą wynikać z błędnej translacji transkryptu informacyjnego RNA (mRNA) i/lub modyfikacji potranslacyjnych, takich jak deamidacja, utlenianie lub glikozylacja.

Kolumna IEX musi być wybrana w oparciu o punkt izoelektryczny analitu (pI).  Jeśli pH fazy ruchomej jest niższe niż pI, analit będzie naładowany dodatnio i zwiąże się z kolumną kationowymienną.

Chromatografia powinowactwa

Chromatografia powinowactwa opiera się na specyficznej interakcji między analitem a ligandem fazy stacjonarnej. W idealnym przypadku tylko interesujący analit łączy się z fazą stacjonarną, pozwalając wszystkim innym składnikom próbki przejść przez kolumnę. Druga faza ruchoma jest następnie przepuszczana przez kolumnę w celu elucji analitu.

Chromatografia białka A jest najczęstszą formą chromatografii powinowactwa stosowaną w przemyśle biofarmaceutycznym.  Białko A jest białkiem powierzchniowym o masie 42 kDa występującym w ścianie komórkowej S. aureus.Białko to wiąże się specyficznie z łańcuchem ciężkim w regionie Fc IgG, dzięki czemu jest to idealny mechanizm do oddzielania IgG od innych składników próbki.  Większość kolumn z białkiem A jest wytwarzana poprzez unieruchomienie białka na porowatej, organicznej cząsteczce.  Jednak wyprodukowano monolityczny format do chromatografii białka A, pozwalający na wysoką przepustowość próbki przy różnych prędkościach przepływu, bez poświęcania wydajności.

Najważniejsze wydarzenia

Kalkulator transferu metody HPLC

Oblicz oszczędność czasu pracy i zużycia rozpuszczalnika podczas przenoszenia metody z warunków HPLC do warunków UHPLC. Uzyskaj wskazówki dotyczące zmiany przeciwciśnienia, a także sposobu dostosowania objętości wtrysku i warunków gradientu.