Przejdź do zawartości
Merck
Strona głównaHPLC małych cząsteczekPrzewodnik rozwiązywania problemów HPLC

Przewodnik rozwiązywania problemów HPLC

Jak identyfikować, izolować i korygować najczęstsze problemy HPLC

Chociaż opracowywanie metod HPLC zostało udoskonalone dzięki postępowi w technologii kolumn i oprzyrządowania, nadal pojawiają się problemy. Każdy poradnik dotyczący rozwiązywania problemów wspomina o powtarzalności selektywności jako najważniejszym kryterium dotyczącym kolumn, dlatego większość producentów dołożyła wszelkich starań, aby zweryfikować swoje procesy produkcyjne. Niemniej jednak, niewielkie różnice występujące w składzie chemicznym powierzchni mają tendencję do pojawiania się podczas analizy bardzo wrażliwych próbek. Praktycznie niemożliwe jest wyeliminowanie ich wszystkich podczas produkcji ze względu na zmienne: surowe materiały i odczynniki, chemię wiązań powierzchniowych, sam proces pakowania, a także paker kolumny, sprzęt laboratoryjny i środowisko. Ponadto, chemia powierzchni ma tendencję do zmiany podczas użytkowania kolumny. Faza związana ulega dezintegracji, krzemionka rozpuszcza się jako krzemian, a rozszerzona powierzchnia ma tendencję do adsorpcji zanieczyszczeń z próbki i fazy ruchomej. Dlatego te niewielkie różnice muszą być kompensowane przez wytrzymałość metody.

W tym przewodniku oferujemy systematyczne sposoby izolowania, identyfikowania i korygowania wielu typowych problemów HPLC.

Najważniejsze jest, aby pamiętać o czterech prostych głównych zasadach:

  1. Zasada "jednego": nigdy nie zmieniaj więcej niż jednej rzeczy na raz. Dokonywanie kilku zmian utrudnia spekulowanie, z którego efektu zmiany wynikają.
  2. Zasada "dwa": każdy efekt lub problem musi być powtarzalny, aby móc go rozwiązać. Jeśli nie można powtórzyć problemu chromatograficznego, bardzo trudno jest dowiedzieć się, co go powoduje i jak go naprawić.
  3. "Odłóż to na później": w końcu często można uniknąć problemów poprzez rutynową konserwację (np. planowaną wymianę zużytych części) w regularnych odstępach czasu, prowadząc dobrą dokumentację tego, co zostało zrobione i kiedy.
  4. Prowadzenie dokładnych zapisów: Większość problemów nie pojawia się z dnia na dzień, lecz rozwija się stopniowo. Dokładne prowadzenie dokumentacji jest niezbędne do wykrywania i rozwiązywania wielu problemów.
    Oceniaj każdą kolumnę, którą otrzymujesz w momencie jej otrzymania, a następnie w regularnych odstępach czasu. Prowadząc pisemną historię wydajności kolumny, używanych faz ruchomych, prądu lampy, wydajności pompy itp. można monitorować wydajność systemu.
    Zapisy pomagają również zapobiegać błędom, takim jak wprowadzanie wody do kolumny krzemionkowej lub wytrącanie buforu w systemie przez dodanie zbyt dużej ilości rozpuszczalnika organicznego. Wielu analityków w jakiś sposób modyfikuje swoje systemy HPLC. Wiarygodne zapisy są najlepszym sposobem na zapewnienie, że modyfikacja nie spowoduje problemów. W przypadku problemów związanych z pompami, detektorami, automatycznymi próbnikami i systemami danych, należy zapoznać się z instrukcją rozwiązywania problemów w podręczniku urządzenia lub skontaktować się z inżynierem serwisu urządzenia.

Ważne segmenty systemu HPLC są takie same, niezależnie od tego, czy używasz systemu modułowego, czy bardziej zaawansowanej jednostki. Problemy wpływające na ogólną wydajność systemu mogą pojawić się w każdym komponencie. Poniżej omówiono niektóre typowe problemy i kwestie, które mogą się pojawić oraz sposoby ich rozwiązywania. Chromatografowie często muszą identyfikować i rozwiązywać problemy, które można podzielić na różne kategorie. Rozwiązania tych problemów przedstawiono w łatwych w użyciu tabelach.

W systemie HPLC problemy mogą wynikać z wielu źródeł. Najpierw należy zdefiniować problem, a następnie wyizolować jego źródło.

Określ, który komponent(y) może(mogą) powodować problemy. Proces eliminacji zazwyczaj umożliwia wskazanie konkretnej przyczyny i skorygowanie problemu.

Chcesz przenieść swoją metodę HPLC do metody UHPLC? Uzyskaj pomoc w obliczeniu czasu pracy i oszczędności zużycia rozpuszczalnika dzięki przeniesieniu metod za pomocą naszego Kalkulatora przeniesienia metody HPLC.

The image illustrates the typical components of an HPLC (High-Performance Liquid Chromatography) system. At the top are two beakers containing solvents on a grey block representing the solvent compartment. Below the solvent compartment is the degasser, followed by the pump and then the injection system. Beneath the injection system is a yellow-colored block representing the thermostat, within which a column is visible. Below the thermostat is a grey block representing the detector, followed by the fraction collector. On the right side of the image, there is a computer screen displaying a chromatogram, accompanied by a keyboard, mouse, and CPU, representing the data acquisition system.

Figure 1.Components of an HPLC System

Najważniejszą częścią zestawu chromatograficznego jest kolumna. Ale nawet jeśli zapewnia ona retencję, ostateczny rozdział zależy również w dużym stopniu od fazy ruchomej (MP). Różne efekty oferowane przez fazę ruchomą wpływają na retencję i migrację różnicową (selektywność) substancji rozpuszczonych przez kolumnę. Niska czułość i rosnące linie bazowe, szumy lub skoki na chromatogramie można często przypisać zanieczyszczeniu fazy ruchomej. Zanieczyszczenia w fazie ruchomej są szczególnie kłopotliwe w przypadku elucji gradientowej, ponieważ nagromadzenie nawet niewielkich zanieczyszczeń może następować z czasem, "czekając" na zwiększoną moc elucyjną fazy ruchomej. Linia bazowa może wzrosnąć, a fałszywe piki mogą pojawić się wraz ze wzrostem poziomu zanieczyszczonego składnika.

Często problemy z rozdzielaniem chromatograficznym są związane z nieprawidłowo/niekonsekwentnie przygotowaną fazą ruchomą. W związku z tym można zaobserwować tendencję do stosowania prostszych faz ruchomych ze względów praktycznych, takich jak zwiększona niezawodność metody, łatwiejszy transfer metody i łatwość użycia (np. w diagnostyce klinicznej lub kontroli procesu).

Większość z Was zna zasadę: "garbage in, garbage out." To powiedzenie jest szczególnie prawdziwe przy wyborze odpowiedniej czystości składników fazy ruchomej. Na przykład, absolutną koniecznością jest stosowanie rozpuszczalników i odczynników klasy gradientowej do separacji gradientowej w celu uzyskania dokładnej, powtarzalnej i czystej linii bazowej (wolnej od pików widmowych) oraz czułej separacji chromatograficznej. Używanie właściwej i odpowiedniej klasy rozpuszczalników w oparciu o metodę aplikacji (np, hypergrade dla LC-MS, zobacz więcej na SigmaAldrich.com/solvents)  minimalizuje również ryzyko zanieczyszczenia i wydłuża żywotność kolumny chromatograficznej.

Woda jest najczęstszym źródłem zanieczyszczeń w analizach z odwróconą fazą. Należy używać wyłącznie wody o wysokiej czystości, klasy HPLC lub LC-MS, w zależności od analiz. Może to być dostępna w handlu woda butelkowana lub ultraczysta woda z odpowiedniego systemu oczyszczania wody Milli-Q®. Systemy Ultrapure Milli-Q® są doskonałym wyborem dla chromatografów, ponieważ oferują unikalne połączenie zoptymalizowanego oczyszczania wody, w tym filtr końcowy zawierający krzemionkę C18 w odwróconej fazie, oraz technologie monitorowania. Wybór optymalnego systemu wody ultraczystej (typu 1) dla danego laboratorium będzie zależał od kilku parametrów, takich jak: dostępna jakość wody zasilającej, dzienne zapotrzebowanie na objętość, wymagania dotyczące monitorowania, oczekiwane poziomy certyfikacji i wszelkie inne specyficzne wymagania. Jeśli używasz wody destylowanej lub dejonizowanej (DI), pamiętaj, że popularne dejonizatory mogą wprowadzać zanieczyszczenia organiczne do wody, narażając analizy na ryzyko.

Używaj tylko rozpuszczalników klasy HPLC (lub LC-MS), soli, odczynników par jonowych oraz modyfikatorów zasad i kwasów. Czyszczenie rozpuszczalników niższej jakości jest czasochłonne i często pozostają w nich śladowe ilości zanieczyszczeń. Te śladowe zanieczyszczenia mogą powodować problemy podczas korzystania z detektora ultrafioletu, fluorescencji lub spektrometrii mas (MS) o wysokiej czułości. Jeśli używasz spektrometrii mas jako detektora końcowego, użyj rozpuszczalników i dodatków klasy MS, aby zapewnić najwyższą ogólną czułość metody i uniknąć zanieczyszczenia instrumentu MS.

Ponieważ wiele buforów wodnych sprzyja rozwojowi bakterii lub glonów, należy przygotować te roztwory świeże i przefiltrować je za pomocą filtra membranowego 0,22 μm, jeśli wykonujesz analizę UHPLC lub filtra 0,45 μm do standardowej analizy HPLC przed użyciem. Filtrowanie usunie również cząstki, które mogą powodować zakłócenia linii bazowej lub zatkać kolumnę. Zapobieganie rozwojowi mikroorganizmów poprzez dodanie około 100 ppm azydku sodu do buforów wodnych. Alternatywnie, bufory te można również zmieszać z 20% lub więcej rozpuszczalnika organicznego, takiego jak etanol, acetonitryl, metanol lub izopropanol.

W przypadkach wymagających dodania dowolnego odczynnika, takiego jak bufor, należy upewnić się, że odczynnik spełnia wymaganą jakość i nie upłynął jego termin ważności. Degradanty z przeterminowanych dodatków prowadzą do pików widmowych na chromatogramach próbek. Niektóre dodatki ulegają degradacji szybciej, w zależności od ich charakteru (na przykład bufor fosforanowy 20 mM, pH 7). Niewłaściwe/nieostrożne obchodzenie się z tymi odczynnikami (np. wlewanie resztek rozpuszczalnika z powrotem do butelki, pozostawienie butelki na stole laboratoryjnym bez zakrętki, zgubienie końcówek pipet pływających wewnątrz butelki itp.

W przypadku separacji izokratycznych z użyciem wstępnie zmieszanych faz ruchomych, podczas ich przygotowywania należy wziąć pod uwagę skurcz objętościowy rozpuszczalnika w powszechnie stosowanych mieszaninach (woda/acetonitryl, metanol lub tetrahydrofuran). Jedynym prawidłowym sposobem przygotowania takich mieszanin faz ruchomych jest oddzielne pobranie dokładnie odmierzonych objętości składników i zmieszanie ich. Na przykład, aby uzyskać 70% organiczną fazę ruchomą, 300 ml wody i 700 ml rozpuszczalnika organicznego należy dokładnie odmierzyć oddzielnie, a następnie połączyć w kolbie. Ale jeśli tylko woda zostanie dokładnie odmierzona, a następnie rozpuszczalnik organiczny zostanie dodany w celu uzupełnienia wymaganej objętości końcowej, ze względu na kurczenie się mieszaniny rozpuszczalników, wynikowa moc rozpuszczalnika będzie nieco wyższa (lub słabsza w przypadku, gdy rozpuszczalnik organiczny został dodany jako pierwszy, a woda została dodana później). W przypadku wstępnego mieszania MP należy zwrócić uwagę na toksyczne opary rozpuszczalnika, które mogą być emitowane pod wyciągiem.

Obecnie gradienty są generalnie prawidłowo formułowane przy użyciu pomp gradientowych; jednak pewne niewielkie różnice w zachowaniu retencji można zaobserwować podczas porównywania instrumentów z niskociśnieniowymi i wysokociśnieniowymi systemami gradientowymi ze względu na ich mechanizmy mieszania. Oba podejścia mają wady i zalety - aparaty do formowania gradientowego pod niskim ciśnieniem są prostsze, a zatem łatwiejsze w utrzymaniu, ale ich główną zaletą jest stały przepływ niezależny od gradientu. Przepływ uzyskany z systemów formowania gradientowego pod wysokim ciśnieniem jest o kilka procent niższy, ze względu na kurczenie się rozpuszczalnika po zmieszaniu. Zjawisko to należy mieć na uwadze, jeśli ktoś przenosi ustaloną metodę z jednego typu urządzenia na drugie.

W chromatografii z odwróconymi fazami w większości przypadków lepiej jest pracować z wstępnie zmieszanymi fazami ruchomymi, takimi jak 5% acetonitrylu w wodzie i/lub 5% wody w acetonitrylu. Uzasadnieniem takich preferencji jest zwiększenie skuteczności odgazowywania, uniknięcie ogrzewania mieszaniny (np. metanolu w wodzie) lub chłodzenia (np. acetonitrylu w wodzie) podczas mieszania, a także poprawa wydajności mieszania poprzez upodobnienie dwóch faz ruchomych pod względem lepkości i napięcia powierzchniowego. Ograniczenia takich wstępnie zmieszanych rozpuszczalników polegają na tym, że moc rozpuszczalnika fazy ruchomej B nie może wynosić 100% i że jest to dodatkowy krok w przygotowaniu fazy ruchomej - co jest dodatkowym, potencjalnym źródłem błędu. Zazwyczaj zaleca się stosowanie rozpuszczalników fazy ruchomej bezpośrednio z ich pojemników dostawczych, aby zapobiec dodatkowym szansom na zanieczyszczenie.

Podczas analizy próbek zawierających związki jonizowalne, bufor może być jedną z najważniejszych zmiennych kontrolujących retencję w separacji HPLC. pH fazy ruchomej określa obecność jonizowalnych związków (analitów i matrycy) w stanie zjonizowanym lub niezjonizowanym. Gatunki zjonizowane w chromatografii w fazie odwróconej (RP) zawsze eluują z kolumny wcześniej niż gatunki niezjonizowane. Zmiana pH może również zwiększyć selektywność skutecznej separacji blisko eluujących lub nakładających się pików. Zmienność pH między seriami powoduje niespójność separacji. Bufory zapobiegają zmianom pH. Dlatego właściwy wybór buforu, pod względem gatunków buforujących, siły jonowej i pH, jest najbardziej krytycznym krokiem w opracowywaniu metody HPLC, gdy analizowane są substancje jonizowalne.

Wybór buforu. Wybór odpowiedniego buforu do danego zastosowania zależy od właściwości buforu, takich jak pKa, zakres pH i odcięcie UV. Zasadniczo bufory powinny być używane dla pH w zakresie +/- 1 jednostki ich wartości pKa. W tym zakresie bufory są odporne na wszelkie celowe próby zmiany pH. Pojemność buforu jest maksymalna, gdy pH buforu jest równe jego pKa. Należy również wziąć pod uwagę wartość odcięcia UV, ponieważ długość fali wykrywania nie powinna zakłócać absorbancji buforu (znacząca absorbancja: kwas trifluorooctowy < 220 nm; kwas mrówkowy, kwas octowy < 240 nm). Aby uzyskać najlepsze wyniki z jonizowalnym analitem będącym przedmiotem zainteresowania, należy użyć buforu o pH co najmniej 2 jednostki od pKa. Jeśli pH fazy ruchomej jest zbyt zbliżone do pKa analitu, można zaobserwować rozdzielone piki lub ramiona z powodu obecności obu gatunków w próbce. W przypadku kilku jonizowalnych analitów, preferowane jest wybranie wartości pH, przy której wszystkie anality występują w tej samej formie, zjonizowanej lub niezjonizowanej.

  • Pomiar pH buforu. pH buforu to pH części wodnej przed dodaniem organicznej fazy ruchomej. Dodanie rozpuszczalnika organicznego zwykle przesuwa pH w górę lub w dół (przesunięcie pH powinno być stałe dla tego samego buforu). Nie jest tak ważne, aby znać dokładną wartość pH buforu w środowisku organicznym, ale ważne jest, aby mieć spójną wartość pH (ponieważ pKa analitów jest również określane w fazie wodnej, a my również nie znamy indywidualnych przesunięć pKa).
  • Chemical Purity. Jakość/czystość dodatków do fazy ruchomej (buforów, soli, kwasów i zasad) wraz z rozpuszczalnikami organicznymi wykorzystywanymi w eksperymencie HPLC musi być dostosowana do czułości detektora i protokołu elucji.
  • Kompatybilność chemiczna. Skład buforu, wraz z pH fazy ruchomej, musi być dobrany w porozumieniu z materiałem obudowy kolumny i charakterem fazy stacjonarnej, aby zapobiec ich korozji.
  • Kompatybilność MS. Nie zaleca się wprowadzania soli mineralnych do systemu spektrometrii mas. Przykładami odpowiednich buforów lotnych są octan amonu, mrówczan amonu i cytrynian amonu. Modyfikatory pH, takie jak kwas mrówkowy i kwas octowy, powinny być stosowane do kontrolowania pH i wspomagania jonizacji w LC-MS.
  • Rozpuszczalność buforu. W idealnym przypadku bufor powinien być całkowicie rozpuszczalny w wodzie (metody RP) i nie powinien wytrącać się podczas analizy po zmieszaniu z wybranym rozpuszczalnikiem organicznym. Stężenie buforu musi być zatem starannie dobrane, aby uniknąć wytrącania przy wyższych stężeniach w rozpuszczalniku organicznym. Jeśli zostanie to zaniedbane, może to spowodować problemy operacyjne z pompami i wywołać zablokowanie kolumny HPLC lub wzrost ciśnienia wstecznego.
  • Siła buforu. Eluent wykazujący słabe oddziaływanie z fazą stacjonarną jest w stanie eluować tylko słabo związane anality z kolumny, podczas gdy silne oddziaływanie powoduje elucję silnie związanych cząsteczek próbki. Siła elucji lub rozpuszczania różnych rozpuszczalników zależy od rodzaju zastosowanej fazy stacjonarnej. Po sile elucji, lepkość buforu odgrywa ważną rolę pod względem jego przydatności do stosowania w analizach HPLC.
  • Stężenie buforu. Najlepiej jest wybrać najniższe stężenie, które daje powtarzalne wyniki. Wyższe stężenia prowadzą do szybszej elucji cząsteczek polarnych. Ogólnie, stężenie buforu nie powinno być niższe niż 5 mM. Poniżej tego stężenia bufor może nie działać jako bufor (zależy to od stężenia analitu i zdolności buforowania). Zwiększenie stężenia buforu może zwiększyć lepkość, co z kolei może zwiększyć przeciwciśnienie w kolumnie. Zazwyczaj stężenie powinno być utrzymywane w zakresie od 5 do 100 mM. Stężenie buforów soli mineralnych wyższe niż 100 mM powoduje szybsze zużycie ruchomych części pompy, dlatego zaleca się zainstalowanie płukania wstecznego.

Można zauważyć, że bufory odgrywają kluczową rolę w większości separacji HPLC. Rozwój metod często wymaga starannego doboru buforów i odpowiedniej staranności w ich przygotowaniu. Tak więc, ogólne zasady, o których należy pamiętać to - roztwory buforowe muszą być jednorodne, klarowne i wolne od jakichkolwiek cząstek. W przypadku przechowywania należy pamiętać, że bufory mają ograniczoną żywotność, dlatego należy je przygotowywać codziennie.

Odgazowanie fazy ruchomej

Odgazowanie fazy ruchomej w chromatografii ma ogromne znaczenie dla uzyskania dokładnych i powtarzalnych wyników. Odgazowanie fazy ruchomej polega na usunięciu rozpuszczonych gazów, w szczególności tlenu i dwutlenku węgla, które mogą niekorzystnie wpływać na wydajność systemu chromatograficznego. Obecność tych gazów może prowadzić do niestabilności linii bazowej, szumów detektora i zmian czasów retencji, z których wszystkie mogą zagrozić wiarygodności danych chromatograficznych. Ponadto odgazowanie pomaga zapobiegać tworzeniu się pęcherzyków gazu w pompie i kolumnie chromatograficznej, co może wpływać na precyzję dostarczania eluentu i powodować wahania natężenia przepływu. Konsekwentne i wydajne odgazowywanie jest szczególnie istotne w systemach wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), gdzie precyzyjne i stabilne warunki są niezbędne do uzyskania dokładnych kształtów pików i rozdzielczości. Ogólnie rzecz biorąc, odgazowanie fazy ruchomej jest niezbędnym krokiem w metodologii chromatograficznej, zapewniającym powtarzalność i dokładność wyników analitycznych oraz utrzymującym solidność systemu chromatograficznego. Aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków w systemie, należy dokładnie odgazować fazę ruchomą. Ogólnie rzecz biorąc, odgazowywacz in-line jest pierwszym i najlepszym wyborem (tani i skuteczny), ale sonikacja (łatwe, ale niekompletne odgazowanie) lub rozpylanie helem (bardzo skuteczne, ale drogie) może być alternatywą, jeśli faza ruchoma nie zawiera żadnych lotnych składników. Niska temperatura zwiększa rozpuszczalność gazów, dlatego rozpuszczalniki przechowywane w lodówce należy ustabilizować do temperatury pokojowej lub dodatkowo odgazować za pomocą innych metod (na przykład sonikacji) przed wprowadzeniem do systemu polegającego na odgazowaniu próżniowym online.

Pompa musi zapewniać stały przepływ rozpuszczalnika do kolumny w szerokim zakresie warunków. Pompy HPLC zawierają pojedyncze lub podwójne tłoki, strzykawki lub pompy membranowe. Pompy te mogą być nisko- lub wysokociśnieniowymi systemami gradientowymi (Rysunki 2 & 3). Oba podejścia są stosowane, jednak wysokociśnieniowa pompa gradientowa może dostarczać natężenie przepływu do 4% niższe niż ustawiona wartość z powodu skurczu rozpuszczalnika po wymieszaniu, potencjalnie wpływając na precyzję separacji chromatograficznych. Z drugiej strony, niskociśnieniowa pompa gradientowa opóźnia dotarcie gradientu do kolumny, wprowadzając wyzwania w utrzymaniu precyzyjnych warunków elucji, szczególnie wyraźne przy użyciu stromych gradientów o dużej prędkości. Te cechy operacyjne należy dokładnie rozważyć przy wyborze systemu pompy w oparciu o specyficzne wymagania analizy chromatograficznej, szczególnie przy przenoszeniu metody z jednego urządzenia do drugiego.

Illustration of a high-pressure gradient system featuring two pumps. These systems are constrained to two solvents, each pumped by an individual pump. The mixer is positioned on the high-pressure side of the pumps.

Figure 2High-pressure gradient system

Diagram depicting a low-pressure gradient system demonstrating a single pump with an integrated mixing block, simultaneously delivering two distinct solvents.

Figure 3.Low-pressure gradient system

 

Problemy z pompami chromatograficznymi mogą obejmować różne kwestie, które mogą wpływać na wydajność i niezawodność pompy w chromatografii. 

>

Rozwiązanie tych problemów często wymaga rutynowej konserwacji, sprawdzania i wymiany materiałów eksploatacyjnych oraz zapewnienia prawidłowej kalibracji i działania pompy chromatograficznej. Regularne kontrole systemu i przestrzeganie zalecanych harmonogramów konserwacji są niezbędne do uzyskania optymalnej wydajności chromatograficznej.

Problemy z systemem pompowania są zazwyczaj łatwe do wykrycia i skorygowania. Cechą charakterystyczną problemów z układem pompowym jest powtarzający się hałas bazowy, którego częstotliwość wzrasta proporcjonalnie do natężenia przepływu. Pewnym znakiem nieszczelności jest nagromadzenie soli na połączeniu pompy. Sole buforowe powinny być codziennie wypłukiwane z systemu za pomocą świeżej, dejonizowanej wody. Aby wyizolować i naprawić określone problemy związane z urządzeniem, należy skorzystać z sekcji rozwiązywania problemów i konserwacji w instrukcji obsługi lub skontaktować się z dostawcą urządzenia. Uszczelki pompy wymagają okresowej wymiany. Program konserwacji zapobiegawczej jest wysoce zalecany przy zakupie nowego systemu (U)HPLC.

Wtryskiwacz szybko wprowadza próbkę do systemu przy minimalnym zakłóceniu przepływu rozpuszczalnika. Systemy HPLC wykorzystują obecnie wtryskiwacze o zmiennej pętli, stałej pętli i strzykawkowe. Te konfiguracje są aktywowane ręcznie, pneumatycznie lub elektrycznie.

Problemy mechaniczne związane z wtryskiwaczem (np. wycieki, zatkane rurki kapilarne, zużyte uszczelki) są łatwe do wykrycia, a ich korygowanie wiąże się z rozwiązywaniem różnych kwestii, które mogą mieć wpływ na jakość i powtarzalność wyników chromatograficznych. Użyj filtra przedkolumnowego, aby zapobiec zatykaniu się fryty kolumny z powodu fizycznej degradacji uszczelki wtryskiwacza. Inne problemy, takie jak niereprodukowalne iniekcje, są trudniejsze do rozwiązania.

Zmienne wysokości pików, rozszczepione piki i szerokie piki mogą być spowodowane niekompletnie wypełnionymi pętlami próbek, niezgodnością rozpuszczalnika iniekcyjnego z fazą ruchomą lub słabą rozpuszczalnością próbki. W miarę możliwości należy rozpuszczać i wstrzykiwać próbki w fazie ruchomej, która przepływa przez kolumnę w momencie wstrzyknięcia. W przeciwnym razie należy upewnić się, że rozpuszczalnik iniekcyjny ma mniejszą siłę eluotropową niż faza ruchoma. Należy pamiętać, że niektóre autosamplery używają oddzielnych roztworów do płukania strzykawek. Należy upewnić się, że roztwór płuczący jest kompatybilny i słabszy niż faza ruchoma. Fakt ten jest szczególnie ważny podczas przełączania między fazą odwróconą i normalną lub analizami chromatografii cieczowej z interakcją hydrofilową (HILIC). Zapewnienie czystości zewnętrznej powierzchni igły iniekcyjnej ma również kluczowe znaczenie, szczególnie w przypadku próbek o wysokim stężeniu lub lepkości. Zewnętrzne mycie igły jest zalecane, aby zapobiec wszelkim pozostałościom po poprzednich wstrzyknięciach i uniknąć zanieczyszczenia portu zestawu igły iniekcyjnej, co mogłoby zagrozić dokładności kolejnych analiz i spowodować zanieczyszczenie krzyżowe między różnymi próbkami. Można to osiągnąć poprzez zanurzenie igły w jednej lub kilku fiolkach zawierających roztwory myjące przeznaczone do dokładnego czyszczenia zewnętrznej części igły. Właściwe mycie zewnętrzne nie tylko pomaga utrzymać integralność systemu chromatograficznego, ale ostatecznie przyczynia się do precyzji i wiarygodności wyników analitycznych.

Właściwe przygotowanie próbki jest krytycznym aspektem zapewnienia dokładności i wiarygodności analiz chromatograficznych. Konieczne jest filtrowanie próbek przed wstrzyknięciem, aby zapobiec potencjalnemu zatkaniu igły wtryskiwacza i późniejszym problemom z systemem. Filtrowanie usuwa cząstki stałe, które mogą blokować wąskie kanały igły iniekcyjnej, zapewniając płynny i spójny proces iniekcji. Ponadto podczas pobierania próbek z fiolek zaleca się unikanie wstrzykiwania z dna fiolki, ponieważ z czasem może gromadzić się osad. Sedymentacja może prowadzić do wprowadzenia niepożądanych cząstek do układu chromatograficznego, zatykając/zanieczyszczając kolumnę. Przestrzegając najlepszych praktyk, takich jak filtrowanie próbek i unikanie wstrzykiwania z dna fiolki, analitycy przyczyniają się do ogólnej wiarygodności i precyzji wyników chromatograficznych, minimalizując ryzyko zanieczyszczenia systemu i zapewniając optymalną wydajność.

Filtry wlotowe fazy ruchomej, filtry przed wstrzykiwaczem i przed kolumną oraz kolumny ochronne, choć nie stanowią integralnej części większości urządzeń, znacznie zmniejszają problemy związane ze złożonymi separacjami. Zalecamy filtrowanie wszystkich próbek przez filtry strzykawkowe 0,45 μm lub 0,2 μm.

Filtry wewnętrzne odgrywają kluczową rolę w systemach chromatograficznych, służąc jako niezbędne elementy poprawiające jakość i trwałość kolumn analitycznych. Umieszczone strategicznie w ścieżce płynu, filtry te skutecznie wychwytują cząstki stałe, zanieczyszczenia lub zanieczyszczenia obecne w fazie ruchomej lub próbce, zanim dotrą do kolumny chromatograficznej. Zapobiegając przedostawaniu się niepożądanych cząstek, filtry inline przyczyniają się do ochrony i zachowania materiału wypełnienia kolumny, wydłużając w ten sposób jej żywotność i zapewniając spójne i powtarzalne separacje. Filtry inline nie mają na celu zastąpienia filtracji, ale są raczej dodatkowym zabezpieczeniem kolumny. Zaleca się, aby porowatość filtrów liniowych była mniejsza niż fryty wlotowej kolumny. Na przykład, fryta na głowicy kolumny wypełniona cząstkami o wielkości 5 µm wynosi 2 µm, w tym przypadku porowatość filtra inline powinna wynosić ~1-0,5 µm. Gdy ciśnienie wsteczne w systemie zacznie rosnąć, należy sprawdzić i w razie potrzeby wymienić filtr liniowy.

We wszystkich przypadkach zdecydowanie zalecamy stosowanie kolumn ochronnych. Faza stacjonarna w kolumnie ochronnej powinna być dopasowana do kolumny analitycznej, tak aby wychwytywała substancje, które nieodwracalnie zaadsorbowałyby się na kolumnie analitycznej, ograniczając jej żywotność. Kolumna ochronna działa jak element ofiarny w systemie chromatograficznym. Żywotność tych jednorazowych produktów zależy od składu fazy ruchomej, objętości wtrysku, czystości próbki, pH itp. Gdy urządzenia te ulegają zanieczyszczeniu lub zatkaniu cząstkami, wzrasta ciśnienie, a piki poszerzają się lub rozdzielają. 

Niezależnie od tego, czy kolumna zawiera fazę odwróconą lub normalną, wymianę jonową, powinowactwo, oddziaływanie hydrofobowe, wykluczenie wielkości lub wypełnienie na bazie żywicy/krzemionki, najczęstszym problemem związanym z kolumnami analitycznymi jest pogorszenie jakości. Objawy pogorszenia jakości to słaby kształt piku, rozszczepione piki, ramiona, utrata rozdzielczości, skrócone czasy retencji i wysokie ciśnienie wsteczne. Objawy te wskazują, że zanieczyszczenia nagromadziły się na frycie lub wlocie kolumny, lub że w złożu znajdują się puste przestrzenie, kanały lub zagłębienia.

Pogorszenie jakości jest bardziej widoczne w kolumnach o wyższej wydajności. Na przykład, wypełnienie o grubości 3,0 µm zatrzymywane przez frytę o grubości 0,5 µm jest bardziej podatne na zatykanie niż wypełnienie o grubości 5 lub 10 µm zatrzymywane przez frytę o grubości 2,0 µm lub większą. Właściwa ochrona kolumny i przygotowanie próbki są niezbędne, aby w pełni wykorzystać możliwości każdej kolumny.

Przeciążenie kolumny może powodować słabe kształty pików i inne problemy.

Przeciążenie kolumny może powodować słabe kształty pików i inne problemy.

Pojemność kolumny zależy od wielu czynników, ale typowe wartości dla całkowitej maksymalnej objętości wtrysku i ilości próbek analitów na kolumnie podano w poniższej tabeli. Za maksymalną objętość wtrysku uważa się nie więcej niż 2% całkowitej objętości kolumny, a typowe stężenie próbki w HPLC wynosi około 1 mg/ml. Należy pamiętać, że wydajność i rozdzielczość zwykle zwiększają się wraz ze zmniejszeniem objętości wtrysku.

Problemy z detektorami dzielą się na dwie kategorie - elektryczne i mechaniczne/optyczne. W przypadku problemów elektrycznych należy skontaktować się z producentem urządzenia. Problemy mechaniczne lub optyczne zwykle można przypisać do celi pomiarowej. Problemy z detektorami obejmują zanieczyszczenie celi, pęcherzyki powietrza i wycieki. Powodują one zazwyczaj niską czułość, dryfty, dźwięki linii bazowej lub skoki na chromatogramach. Niektóre komórki są wrażliwe na ciśnienie, szczególnie te znajdujące się w detektorach współczynnika załamania światła. Natężenia przepływu lub ciśnienia wsteczne przekraczające zalecenia producenta spowodują pęknięcie okna komórki. Stare lub uszkodzone lampy, a także nieprawidłowy czas narastania, wzmocnienie lub tłumienie detektora zmniejszają czułość i wysokość piku.

Niewielkie różnice w składzie fazy ruchomej mogą powodować ogromne różnice w czasie retencji, gdy kolumna jest przeciążona, a to również zmienia się wraz z temperaturą. Jednak nawet jeśli faza ruchoma jest buforowana, a pompa działa prawidłowo, czasy retencji mogą się wahać, jeśli pH jest zbyt zbliżone do pK substancji próbki. Dlatego pH fazy ruchomej powinno być dobrane tak, aby było co najmniej o jedną jednostkę pH powyżej lub poniżej wartości pK rozdzielanych analitów. Dryf czasu retencji wskazuje na niewystarczające kondycjonowanie kolumny. Wraz ze wzrostem żywotności kolumny, czasy retencji mogą przesuwać się w kierunku mniejszej retencji, zwłaszcza jeśli użytkownik pracuje przy kwaśnym pH (≤pH 2). Nagłe zmiany czasu retencji są zwykle spowodowane błędami w systemie.

Three HPLC chromatograms labeled A, B, and C plotted with detector response on the y-axis and time on the x-axis. The chromatogram on the left (labeled A) displays normal peaks colored in green. In contrast, the chromatograms in the middle (labeled B) and right (labeled C) exhibit green-colored peaks, indicating issues with changing retention times.

Figure 4.Variable Retention Times. A) Normal, B) Problem, C) Problem


Równoważenie kolumny chromatograficznej jest kluczowym etapem procesu chromatograficznego, niezbędnym do zapewnienia dokładnych i powtarzalnych wyników. Proces ten polega na umożliwieniu przepływu fazy ruchomej przez kolumnę w określonych warunkach, aż do osiągnięcia stabilnej linii bazowej, wskazującej, że system jest w równowadze.

Equilibration służy kilku ważnym celom. Po pierwsze, pozwala fazie stacjonarnej wewnątrz kolumny na interakcję z fazą ruchomą, zapewniając odpowiednie zwilżenie i kondycjonowanie materiału wypełniającego. Pomaga to w ustaleniu jednolitego rozkładu fazy ruchomej i analitów w kolumnie, optymalizując wydajność separacji i rozdzielczość.

Dodatkowo, wyrównanie pomaga ustabilizować parametry systemu, takie jak ciśnienie, temperatura i natężenie przepływu, minimalizując zmienność podczas kolejnych wstrzyknięć. Pozwalając systemowi osiągnąć stan ustalony, wyrównanie zmniejsza ryzyko dryftu linii bazowej i zapewnia stałą wydajność w czasie.

Jeśli wszystkie piki mają taki sam wygląd na chromatogramie, problem powstał przed rozdzieleniem. Jeśli tylko niektóre piki lub tylko jeden pik na chromatogramie eluują ze zniekształconym kształtem, źródło ma charakter chemiczny.

Szerokie piki są generowane albo przez znaczny wpływ ze strony systemu HPLC (złe połączenia kapilarne, puste objętości, zbyt duże komórki detektora lub źle dobrane stałe czasowe), albo przez słabą wydajność kolumny.

Two HPLC chromatograms labeled A and B, plotted with detector response on the y-axis and time on the x-axis. The chromatogram on the left (labeled A) displays normal peaks colored in green. In contrast, the chromatogram on the right (labeled B) exhibits green-colored peaks, indicating the issue of broad peaks

Figure 5.Typical chromatograms, A). Normal peaks B) Broad peaks


Piki duchów mogą być spowodowane przez nieznane składniki próbki, późno eluujące piki z poprzednich wstrzyknięć, zanieczyszczenia lub problemy z mieszaniem w związku z fazą ruchomą. Dlatego najlepiej jest zawsze rozpuszczać próbkę w eluencie lub w rozpuszczalniku o słabszej sile elucji. Substancje o absorpcji UV niższej niż eluent mogą generować ujemne piki.

Three HPLC chromatograms labeled A, B, and C plotted with detector response on the y-axis and time on the x-axis. The chromatogram on the left (labeled A) displays green-colored peaks as obtained for a previous sample. The chromatogram in the middle (labeled B) is a normal one obtained after injection of a solvent after the sample without any ghost peak, whereas the right (labeled C) exhibits green-colored peaks, including a ghost peak.

Figure 6.HPLC chromatograms, A) Previous sample, B) After injection of solvent following the solvent with no ghost peak, C) After injection of solvent following the solvent showing a ghost peak


Two HPLC chromatograms labeled A and B, plotted with detector response on the y-axis and time on the x-axis. The chromatogram on the left (labeled A) displays normal peaks colored in green. In contrast, the chromatogram on the right (labeled B) exhibits green-colored peaks, indicating the issue of negative peaks.

Figure 7.A) Normal chromatogram, B) Chromatogram with negative peaks


Jeśli wszystkie piki mają ramiona lub eluują jako podwójne piki, przyczyną mogą być zatkane filtry liniowe, fryty wlotowe kolumny, zanieczyszczone prekolumny lub pusta objętość na głowicy kolumny. W większości przypadków kolumnę można przywrócić do pierwotnego stanu poprzez wyczyszczenie lub wymianę filtra wlotowego. Krótkoterminowym rozwiązaniem tego problemu może być również odwrócenie kolumny. Zniszczone złoże na wylocie kolumny tylko w niewielkim stopniu przyczynia się do rozprzestrzeniania się piku.

Two HPLC chromatograms labeled A and B, plotted with detector response on the y-axis and time on the x-axis. The chromatogram on the left (labeled A) displays normal peaks colored in green. In contrast, the chromatogram on the right (labeled B) exhibits green-colored peaks, indicating the issue of fronting peaks.

Figure 8.Typical chromatograms, A) normal without a fronting peak B) with a fronting peak


Ogonienie pików, które są wcześnie eluowane, jest spowodowane efektami dodatkowej kolumny. Aby temu zaradzić, należy sprawdzić cały system - połączenia kapilarne, rurki i komorę detektora. Wtórna, niespecyficzna interakcja z powierzchnią żelu krzemionkowego prowadzi do ogonowania późno eluowanych pików, a nawet do pojawienia się podwójnych pików. Dodanie trietyloaminy lub octanu do fazy ruchomej lub wybranie odpowiedniej fazy stacjonarnej znacznie poprawi postać piku. Niewłaściwie dobrana wartość pH dla fazy ruchomej może również prowadzić do ogonowania pików. Zasadniczo chromatografia powinna być przeprowadzana o jedną jednostkę pH powyżej lub poniżej wartości pK substancji próbki.

Two HPLC chromatograms labeled A and B, plotted with detector response on the y-axis and time on the x-axis. The chromatogram on the left (labeled A) displays normal peaks colored in green. In contrast, the chromatogram on the right (labeled B) exhibits green-colored peaks, indicating the issue of a tailing peaks.

Figure 9.Typical chromatograms, A) Normal without a tailing peak B). With a tailing peak


Three HPLC chromatograms labeled A, B, and C plotted with detector response on the y-axis and time on the x-axis. The chromatogram on the left (labeled A) displays normal peaks colored in green. In contrast, the chromatograms in the middle (labeled B) and right (labeled C) exhibit green-colored peaks, indicating the problem of no peaks or very small peaks.

Figure 10.Typical chromatograms, A) Normal peaks, B) No peaks, C) Very small peaks


Two HPLC chromatograms labeled A and B, plotted with detector response on the y-axis and time on the x-axis. The chromatogram on the left (labeled A) displays normal peaks colored in green. In contrast, the chromatogram on the right (labeled B) exhibits split green-colored peaks.

Figure 11.Typical chromatograms A) Normal peaks B) Split peaks


 Two HPLC chromatograms labeled A and B, plotted with detector response on the y-axis and time on the x-axis. The chromatogram on the left (labeled A) displays normal peaks colored in green. In contrast, the chromatogram on the right (labeled B) exhibits green-colored peaks, with one of the peaks (circled in blue) of a different height.

Figure 12.Typical chromatograms, A) Normal B) One peak with a different height


Two HPLC chromatograms labeled A and B, plotted with detector response on the y-axis and time on the x-axis. The chromatogram on the left (labeled A) displays normal peaks colored in green. In contrast, the chromatogram on the right (labeled B) exhibits green-colored peaks, showing rounded peaks.

Figure 13.Typical chromatograms, A) Normal, B) Rounded Peaks


Na odzysk próbki z kolumny chromatograficznej wpływa wiele czynników, w tym skład chemiczny kolumny, skład fazy ruchomej, właściwości analitu i parametry operacyjne. Wybór materiału wypełnienia kolumny i składu chemicznego fazy stacjonarnej może znacząco wpłynąć na retencję analitu i zachowanie podczas elucji. Optymalizacja wyboru kolumny w celu dopasowania właściwości fizykochemicznych analitu ma kluczowe znaczenie dla zminimalizowania niespecyficznej sorpcji i maksymalizacji odzysku próbki. Skład fazy ruchomej odgrywa kluczową rolę w elucji analitu i odzyskiwaniu próbki. Dostosowując skład i profil gradientu fazy ruchomej, analitycy mogą zwiększyć wydajność elucji analitu i poprawić jego odzysk.

Problem: Słaby odzysk próbki

Często po zainstalowaniu nowych części, zwłaszcza jeśli instalacja nie została wykonana prawidłowo, możemy doświadczyć pewnych wycieków. Dodatkowo, nagły wzrost przeciwciśnienia w układzie może również powodować wycieki. Stare, zużyte, zatkane części również mogą być odpowiedzialne za wycieki.

Problem: Wyciek na kolumnie lub złączkach


Problem: Wyciek z detektora


Problem: Nieszczelność zaworu wtryskowego


Problem: wyciek z pompy

Nagłe zmiany selektywności chromatograficznej mogą wynikać z różnych czynników, w tym kondycjonowania kolumny, składu fazy ruchomej, wpływu matrycy próbki, wahań temperatury i natężenia przepływu oraz degradacji kolumny. Rozumiejąc te czynniki i wdrażając odpowiednie środki w celu złagodzenia ich skutków, analitycy mogą utrzymać wiarygodność i powtarzalność wyników chromatograficznych, zapewniając dokładną i spójną wydajność analityczną.

Problem: Różnice w selektywności

Two HPLC chromatograms labeled A and B, plotted with detector response on the y-axis and time on the x-axis. The chromatogram on the left (labeled A) displays normal peaks colored in green. In contrast, the chromatogram on the right (labeled B) shows peaks closer together than before, indicating a change in selectivity.

Figure 14.Typical chromatograms, A) Normal, B) Problem of change in selectivity


Chromatograficzna linia bazowa służy jako punkt odniesienia do wykrywania analitów w analizie chromatograficznej. Reprezentuje sygnał wytwarzany przez detektor przy braku jakiejkolwiek elucji analitu, wskazując podstawowy poziom szumów i stabilność systemu. Stabilna i dobrze zdefiniowana linia bazowa jest niezbędna do dokładnego wykrywania pików, integracji i kwantyfikacji w analizie chromatograficznej. Wahania lub zakłócenia linii bazowej, takie jak dryf, szum lub skoki, mogą zaciemniać piki analitu i prowadzić do niedokładnych wyników. Czynniki przyczyniające się do zakłóceń linii bazowej obejmują wahania składu fazy ruchomej, temperatury, ciśnienia i czułości detektora, a także kwestie związane z urządzeniem, takie jak szum detektora i zakłócenia elektroniczne. Właściwe techniki korekcji linii bazowej, takie jak odejmowanie linii bazowej lub filtrowanie, są często stosowane w celu zwiększenia stosunku sygnału do szumu i poprawy jakości danych. Ponadto regularna konserwacja systemu, w tym płukanie kolumn, czyszczenie detektora i kalibracja przyrządu, jest niezbędna do utrzymania stabilności linii bazowej i zapewnienia wiarygodności wyników chromatograficznych. Podsumowując, chromatograficzna linia bazowa odgrywa kluczową rolę w analizie chromatograficznej, służąc jako podstawa do dokładnego i precyzyjnego określania stężeń analitów. Utrzymanie stabilności linii bazowej jest niezbędne do uzyskania wiarygodnych i powtarzalnych wyników chromatograficznych w zastosowaniach analitycznych.

Problem: Zakłócenie w czasie pustki


Problem: dryfująca linia bazowa

Two HPLC chromatograms labeled A and B, plotted with detector response on the y-axis and time on the x-axis. The chromatogram on the left (labeled A) displays normal peaks colored in green. In contrast, the chromatogram on the right (labeled B) shows the problem of baseline drift.

Figure 15.Typical chromatograms, A) Normal B) Baseline Drift



Problem: Hałas

Two HPLC chromatograms labeled A and B, plotted with detector response on the y-axis and time on the x-axis. The chromatogram on the left (labeled A) displays normal peaks colored in green. In contrast, the chromatogram on the right (labeled B) shows the problem of baseline noise regular.

Figure 16.Typical chromatograms, A) Normal, B) Baseline noise (regular)


wo HPLC chromatograms labeled A and B, plotted with detector response on the y-axis and time on the x-axis. The chromatogram on the left (labeled A) displays normal peaks colored in green. In contrast, the chromatogram on the right (labeled B) shows the problem of baseline noise irregular.

Figure 17.Typical chromatograms, A) Normal B) Problem (Irregular baseline noise)


Problem z ciśnieniem jest zwykle związany ze zbyt wysokim ciśnieniem wstecznym, a aby wyjaśnić, skąd bierze się problem, dobrą praktyką laboratoryjną jest stopniowe odłączanie systemu, zaczynając od detektora i pracując sekwencyjnie z powrotem do wtryskiwacza, a następnie do pompy.

Problem: Brak przepływu

Two HPLC chromatograms labeled A and B, plotted with detector response on the y-axis and time on the x-axis. The chromatogram on the left (labeled A) displays normal peaks colored in green. In contrast, the chromatogram on the right (labeled B) exhibits green-colored peaks, indicating the issue of no flow.

Figure 18.Typical chromatograms A) Normal, B) Problem (No flow)


Sugerujemy również zapoznanie się z sekcjami dotyczącymi konserwacji i rozwiązywania problemów w instrukcji obsługi urządzenia lub skontaktowanie się z inżynierem serwisu. Nowoczesne systemy HPLC często posiadają funkcje autodiagnostyki, które pomagają wyizolować problematyczny obszar w urządzeniu. W przypadku utrzymujących się problemów związanych z kolumną lub analizą należy skontaktować się z działem obsługi technicznej Supelco.

Pozostałe strony tego przewodnika zawierają procedury przywracania wydajności kolumny po utracie rozdzielczości, retencji lub selektywności, sugestie dotyczące zapobiegania i rozwiązywania problemów sprzętowych z kolumnami oraz wybór produktów do ochrony kolumn z oferty Supelco. Na naszej stronie internetowej można znaleźć kompletną linię akcesoriów, które przedłużają żywotność kolumn i ogólnie upraszczają lub usprawniają analizę (U)HPLC lub FPLC® 

>

Wystawienie kolumny na działanie próbek lub rozpuszczalników zawierających wysoce adsorpcyjne składniki spowoduje wzrost przeciwciśnienia i zmianę selektywności. Często kolumnę można przywrócić do pierwotnej wydajności, stosując odpowiednie protokoły płukania. Podczas regeneracji po płukaniu rozpuszczalnikiem, kolumna powinna zostać odwrócona i przeniesiona z analitycznego systemu HPLC do prostej, niedrogiej pompy. Alternatywnie, należy odłączyć kolumnę od detektora i płukać bezpośrednio do odpadów. Każdy rozpuszczalnik należy przepłukać co najmniej 20, a najlepiej 30 objętościami kolumny.

Najważniejsze jest uważne przeczytanie instrukcji dołączonej do każdej kolumny. Arkusz ten zawiera również informacje na temat sugerowanych procedur pielęgnacji i regeneracji kolumn. Zalecenia te muszą być przestrzegane. Zanieczyszczenie kolumny w górnej części cząstkami stałymi powinno być łatwo usunięte poprzez płukanie kolumny przez około 5 do 20 objętości kolumny w trybie płukania wstecznego, ale tylko wtedy, gdy producent kolumny na to pozwala - ważne jest, aby upewnić się, że obie fryty kolumny (wlotowa i wylotowa) mają taką samą porowatość. Należy pamiętać, że małe cząstki uwięzione głębiej w wypełnieniu kolumny prawdopodobnie nie zostaną usunięte. W wyniku takiego płukania przeciwciśnienie w kolumnie powinno być nieco niższe. Usunięcie niespecyficznie związanego materiału z kolumny jest trudne, a wynik jest zwykle nieprzewidywalny, ponieważ zwykle nie wiemy, jakie związki są zanieczyszczeniami. Współczynnik sukcesu może wynosić od 0 do 100%. Aby w pełni przywrócić upakowanie kolumny, jednorodność dla kolumn wypełnionych cząstkami mniejszymi niż 5 µm jest bardzo mało prawdopodobna. Zwykle płukanie wsteczne kolumny pomaga tylko przez krótki czas.

Jeśli zdecydujesz się na płukanie/regenerację kolumny, poniższe procedury krok po kroku powinny teoretycznie odmłodzić kolumnę, której wydajność pogorszyła się z powodu zanieczyszczenia próbki.

Uwaga! Wszystkie rozpuszczalniki używane do regeneracji kolumny muszą być na tym samym poziomie jakości analitycznej, co zwykle używane z tą kolumną podczas codziennej analizy.

  1. Odłącz i odwróć kolumnę.
  2. Podłącz ją do pompy, ale nie do detektora.
  3. Postępuj zgodnie z odpowiednią procedurą płukania podaną w poniższej tabeli, używając natężenia przepływu, które powoduje ciśnienie wsteczne kolumny 1500-4500 psi, ale nigdy nie wyższe niż maksymalne zalecane ciśnienie w instrukcji obsługi producenta. Jeśli posiadasz kolumnę Supelco®, przeprowadź analizę przy użyciu mieszaniny testowej i warunków wymienionych w arkuszu danych.
  4. Kondycjonuj kolumnę przy użyciu zwykłego rozpuszczalnika
  5. Przeprowadź test kolumny przy użyciu próbki mieszaniny testowej. Wydajność, symetria i pojemność powinny mieścić się w zakresie 10-15% wartości podanych w arkuszu testowym. Jeśli tak nie jest, wymień kolumnę.

Uwaga: Objętości wymienione w tabeli dotyczą kolumn 25 cm x 4,6 mm I.D., które mają objętość kolumny 4,15 ml. Podczas przywracania kolumny o średnicy wewnętrznej 4,6 mm krótszej lub dłuższej niż 25 cm, należy pomnożyć wszystkie objętości przez stosunek długości kolumny do 25 (np. dla kolumny 15 cm: 15/25 lub 0,6 razy objętość). W przypadku przywracania kolumny o średnicy wewnętrznej innej niż 4,6 mm należy pomnożyć wszystkie objętości przez stosunek kwadratu średnicy wewnętrznej kolumny do (4,6)2  (np. dla kolumny o średnicy wewnętrznej 3,2 mm: (3,2)2/(4,6)2 = 10,24/21,16 = 0,48 razy wartości w tabeli).

Procedury przywracania kolumny

Właściwości typowych rozpuszczalników organicznych powszechnie stosowanych w HPLC

Niezwiązane kolumny krzemionkowe narażone na działanie rozpuszczalnika polarnego

Próbki i fazy ruchome zawierające bardzo silnie polarne rozpuszczalniki, takie jak woda lub alkohole, mogą dezaktywować niepowlekane kolumny krzemionkowe HPLC. Działanie to może drastycznie wpłynąć na wydajność kolumny, w szczególności na retencję substancji rozpuszczonej i selektywność. Nawet długotrwałe płukanie kolumny rozpuszczalnikiem niepolarnym tylko częściowo przywraca wydajność kolumny, jednocześnie marnując chemikalia. Roztwór do regeneracji krzemionki (zawierający kwas octowy, dimetoksypropan i chlorek metylenu) może szybko i niedrogo przywrócić wydajność kolumny krzemionkowej poprzez usunięcie uwięzionego materiału polarnego. Pompuj roztwór przez uszkodzoną kolumnę przez 10 minut z prędkością 4 ml/minutę, a następnie przepłukuj fazą ruchomą przez 10 minut z prędkością 2 ml/minutę. Ocenić wydajność kolumny przy użyciu mieszaniny testowej do oceny kolumn krzemionkowych. Wydajność powinna być praktycznie taka sama jak przed wprowadzeniem rozpuszczalnika polarnego.

Przechowywanie w kolumnie może być krótko-, średnio- i długoterminowe.

  • Krótkoterminowe przechowywanie, tj. przez noc, faza ruchoma użyta w ostatniej analizie może pozostać w kolumnie. Alternatywnie, możliwe jest również przejście fazy ruchomej przy bardzo niskim natężeniu przepływu (zwłaszcza jeśli stężenie buforu w fazie ruchomej jest wysokie, 50 mM). W takim przypadku kondycjonowanie kolumny można potencjalnie pominąć przed kontynuowaniem analizy następnego dnia. Opcja ta jest szczególnie zalecana w przypadku separacji w fazie normalnej, gdzie zmiana składu fazy ruchomej może skutkować długotrwałą ponowną kalibracją. Jeśli jednak stężenie buforu w fazie ruchomej jest bardzo wysokie (0,5 M), wówczas żywotność części pompy (np. wtryskiwacza i zaworów przełączających) może zależeć od czasu kontaktu z buforem o wysokim stężeniu. To samo dotyczy kolumny, jeśli pH jest zbliżone do limitu kolumny (dla większości kolumn opartych na krzemionce pH 2 do pH 7). Niektóre sole, w szczególności sole chlorkowe, są bardzo korozyjne dla stali nierdzewnej i mogą atakować ścianki kolumny, a także wlot i wylot fryty. W takich przypadkach kolumnę (i cały system) należy przepłukać mniej agresywną fazą ruchomą. W takim przypadku zalecałbym przepłukanie kolumny fazą ruchomą bogatą w wodę (~90%) przy około 10 objętościach kolumny (przybliżone objętości kolumn dla niektórych popularnych rozmiarów kolumn można znaleźć w poniższej tabeli).

Przybliżone objętości kolumn dla niektórych popularnych wymiarów kolumn i ich wielokrotności

Jeśli odłączasz kolumnę od urządzenia, zatyczki końcowe powinny być szczelnie zamocowane, aby zapobiec parowaniu rozpuszczalnika prowadzącemu do wysuszenia fazy stacjonarnej. Najgorszym scenariuszem jest nieprawidłowo umyta kolumna, która była wcześniej używana z solą o wysokim stężeniu i z czasem wyschła - powstaną kryształy soli, a kolumna najprawdopodobniej zostanie nieodwracalnie uszkodzona. Jednak niektóre kolumny mogą być przechowywane w stanie suchym, a inne nie - należy sprawdzić wytyczne producenta dotyczące pielęgnacji kolumn. Standardowe kolumny HPLC powinny być przechowywane w temperaturze pokojowej i nigdy w lodówce lub zamrażarce (wyjątek stanowią kolumny powinowactwa modyfikowane białkami lub aktywne reaktory enzymatyczne). Zalecenia zawarte w tym paragrafie dotyczą również średnio- i długoterminowego przechowywania kolumn.

  • Przechowywanie w średnich odstępach czasu, tj. 2 dni lub w weekend, kolumny należy przepłukać. Intensywność lub objętość płukania zależy od stężenia buforu używanego podczas analizy. Ogólnie zaleca się, aby najpierw wypłukać środki buforujące z kolumny za pomocą około 10 objętości fazy ruchomej z 10% rozpuszczalnikiem organicznym w wodzie. W tym przypadku płukanie będzie skuteczne, a także unikniemy wytrącania się buforu i możliwych problemów z odwadnianiem kolumny. Następnie kolumna może pozostać podłączona do urządzenia lub odłączona i zamknięta zaślepkami. Przechowywanie kolumny HILIC w mieszaninie acetonitrylu i wody może wymagać długiego czasu na ponowną kalibrację, jeśli w metodzie analitycznej używany jest bufor o niskiej sile jonowej (na przykład 5 mM octan amonu). Dlatego w przypadku kolumn HILIC zaleca się przechowywanie ich w rozpuszczalnikach zawierających 80-90% acetonitrylu i buforach zawierających 5-10 mM octanu amonu lub mrówczanu amonu.
    Fazy jonowymienne i mieszane zawierające grupy funkcyjne kwasu karboksylowego (na przykład słabe fazy kationowymienne) nie mogą być przechowywane w roztworach zawierających alkohole, ze względu na powolną estryfikację i wynikającą z niej zmianę selektywności/pojemności.
  • Dla długotrwałego przechowywania, kolumny oparte na krzemionce, po odpowiednim przemyciu min. 15 objętościami kolumny przy użyciu ~ 10% rozpuszczalnika organicznego w wodzie, powinny być przepłukiwane fazą ruchomą bogatą w organiczne substancje przez min. 10 objętości kolumny i mogą być przechowywane w rozpuszczalniku aprotycznym. Jeśli woda może być również obecna, nie powinna być w wyższych stężeniach, zdecydowanie mniej niż 50%. Najlepszym rozpuszczalnikiem do przechowywania zalecanym w literaturze jest acetonitryl lub metanol (istnieją pewne wyjątki, na przykład kolumny z modyfikacją amidową, które powinny być przechowywane wyłącznie w acetonitrylu). Niektóre badania1 wskazują również, że w warunkach RP szybkość erozji i korozji elementów HPLC ze stali nierdzewnej przy użyciu czystego acetonitrylu lub metanolu była wyższa niż w przypadku zmieszania ich z wodą. Dlatego 90% acetonitryl lub metanol jest doskonałym środkiem do długoterminowego przechowywania większości kolumn z fazą odwróconą. W przypadku kolumn z odwróconą fazą, roztwór do przechowywania stanowi mieszanina izopropanolu i wody (80/20), ze względu na wyższą lepkość izopropanolu; ciśnienie pary i mniejsze ryzyko wyschnięcia kolumny, nawet jeśli złącza końcowe nie są całkowicie uszczelnione. Izopropanol jest również silniejszym eluentem, dlatego po przechowywaniu w izopropanolu możemy być pewni, że jeszcze więcej zanieczyszczeń zostanie wypłukanych niż w przypadku gradientów acetonitrylu lub metanolu. Wreszcie, izopropanol jest również mniej toksyczny. Ważne jest, aby pamiętać, że wszystkie fazy ruchome używane do płukania, mycia lub przechowywania kolumn muszą być tej samej jakości co te używane do analizy. Kolumny powinny być przechowywane w temperaturze pokojowej (wyjątkiem mogą być np. kolumny powinowactwa, jak wspomniano wcześniej) w oryginalnym pudełku, z kopią certyfikatu analizy (CoA) / raportu kolumny, być może także z dziennikiem kolumny, aby zobaczyć poprzednie zastosowania, aby ocenić kolumnę przed przyszłym użyciem.

Jak długo kolumny powinny być przechowywane? To zależy od wielu aspektów. Niektóre kolumny nie zmieniają się nawet po 5 lub 10 latach przechowywania. Jeśli zdecydujesz się wypróbować kolumnę po tak długim okresie przechowywania, załóż, że kolumna najprawdopodobniej wyschła i należy ją ponownie zwilżyć, najpierw przepłukując 100% acetonitrylem (fazy RP), a następnie wyrównując w fazie ruchomej przez około 1 godzinę przed wykonaniem jakichkolwiek pomiarów selektywności. Dodatkowo można przeprowadzić test mieszanki kolumnowej i porównać dane z CoA.

Prawidłowe przechowywanie kolumny ma zasadnicze znaczenie dla prawidłowej chromatografii i dłuższej żywotności kolumny.

Mieszanki testowe kolumn

Mieszanki do oceny wydajności kolumn HPLC.

Dobrze zdefiniowane mieszaniny testowe umożliwiają rozwiązywanie problemów chromatograficznych, optymalizację wydajności systemu i ocenę kolumn w warunkach, w których ich wydajność jest zrozumiała. Nasze mieszaniny testowe wysyłamy w bursztynowych ampułkach, aby zapobiec fotodegradacji, a także dołączamy instrukcje dotyczące prawidłowego użytkowania i interpretacji wyników.

Zapobieganie nieszczelnościom

Nieszczelności są częstym problemem w analizach HPLC. Aby zminimalizować nieszczelności w systemie, należy unikać wymiany sprzętu i złączek pochodzących od różnych producentów. Niekompatybilne złączki można początkowo zmusić do dopasowania, ale separacja może wykazywać problemy, a powtarzające się połączenia mogą ostatecznie spowodować wyciek złączki. Jeśli wymiana jest konieczna, należy użyć odpowiednich adapterów i sprawdzić szczelność wszystkich połączeń przed przystąpieniem do dalszych czynności.

Sole o wysokim stężeniu (>0,2 M) i żrące fazy ruchome mogą zmniejszyć wydajność uszczelnienia pompy. Żywotność uszczelek wirnika wtryskiwacza zależy również od warunków fazy ruchomej, w szczególności pracy przy wysokim pH. W niektórych przypadkach długotrwałe stosowanie odczynników z parą jonową ma wpływ na smarowanie tłoków pompy, co może powodować niewielkie nieszczelności uszczelnienia. Niektóre uszczelki nie działają dobrze z pewnymi rozpuszczalnikami. Przed użyciem pompy w niekorzystnych warunkach należy zapoznać się ze specyfikacjami producenta urządzenia lub skontaktować się z inżynierem serwisu. Aby wymienić uszczelki, należy zapoznać się z sekcją konserwacji w instrukcji obsługi pompy lub ponownie skontaktować się z inżynierem serwisu.

Odblokowanie filtra kolumny

Zatkany filtr kolumny to kolejny częsty problem HPLC. Aby zminimalizować ten problem od samego początku, należy używać filtra przedkolumnowego i kolumny ochronnej. Aby wyczyścić wlot, najpierw odłącz i odwróć kolumnę. Podłącz ją do pompy (ale nie do detektora) i przepompuj rozpuszczalnik z dwukrotnością standardowego natężenia przepływu. Około 5-10 objętości rozpuszczalnika w kolumnie powinno wystarczyć do usunięcia niewielkich ilości cząstek stałych z fryty wlotowej. Oceń wydajność oczyszczonej kolumny przy użyciu standardowej mieszaniny testowej.

Supelco® Aparat do filtracji fazy ruchomej (podłączany do linii aspiracyjnej)

  • Aparat do filtracji 1 (podłączany do kolby bocznej o pojemności 1000 ml): Zawiera szklany zbiornik o pojemności 250 ml, podstawę lejka i korek, zacisk, uchwyt i sito ze stali nierdzewnej, 10 uszczelek teflonowych, 50 filtrów Nylon 66 (47 mm, pory 0,45 μm).
  • Aparat do filtracji 2 (podłączany do linii aspiracyjnej): Zawiera szklany zbiornik 250 ml, stożkową podstawę lejka 34/45, stożkową kolbę 1000 ml 34/45 i szklaną nasadkę, zacisk, uchwyt i sito ze stali nierdzewnej, 10 uszczelek teflonowych, 50 filtrów Nylon 66 (47 mm, pory 0,45 μm).

Chroń swój instrument i kolumny, usuwając cząsteczki i gazy z rozpuszczalników i innych składników fazy ruchomej. Filtry membranowe Nylon 66 są kompatybilne ze wszystkimi rozpuszczalnikami powszechnie stosowanymi w HPLC.

Aparatura do filtracji fazy ruchomej
Loading
Części zamienne do szyb
Loading

Filtry

Filtr przedkolumnowy jest niezbędny do ochrony kolumn HPLC przed cząstkami stałymi, które mogą gromadzić się na frycie kolumny, prowadząc do rozszczepienia pików i wysokiego przeciwciśnienia. Źródłem cząstek stałych są fazy ruchome (zwłaszcza gdy bufory są mieszane z rozpuszczalnikami organicznymi), uszczelki pomp i wtryskiwaczy oraz próbki. Do ochrony kolumn zawierających cząstki o wielkości 5 μm lub większe należy używać filtra 2,0 μm, a w przypadku kolumn z cząstkami mniejszymi niż 5 μm - filtra 0,5 μm.

Supelco Filter

Nasz filtr przedkolumnowy Supelco®  może być podłączony bezpośrednio, ręcznie szczelnie, do dowolnej kolumny HPLC lub kolumny ochronnej wymienionej na naszej stronie internetowej lub do dowolnej innej kolumny wyposażonej w złącza końcowe zgodne z Valco. Nasadka i korpus z PEEK, fryta ze stali nierdzewnej 2 μm. 

>
Frytki i filtry Supelco®
Loading

Valco Precolumn Frit and Screen Filters3

Instalacja w linii. Wydajne filtry o niskiej objętości martwej chronią kolumny przed cząstkami stałymi bez zmniejszania wydajności kolumny. Wymienny fryt 1/8" ma pory 0,5 μm, aby chronić pakiety kolumn 3 μm lub 5 μm, wymienny ekran ma pory 2 μm. Wybierz filtr frytowy, aby uzyskać wyższą wydajność filtracji (większość zastosowań) lub filtr sitowy, aby uzyskać mniejszą objętość martwą (np. w przypadku kolumn z mikrootworami). Używaj z rurkami o średnicy zewnętrznej 1/16 cala; w zestawie złączki 1/16 cala.

Real image of Valco precolumn consisting of stainless steel frit filter and fittings
Filtry przedkolumnowe i fryty Valco
Loading

Filtr przedkolumnowy Isolation Technologies

Instalacja w linii. Filtr wlotowy o dużej pojemności minimalizuje objętość martwą i poszerzenie pasma, aby zapobiec utracie wydajności kolumny, jednocześnie chroniąc kolumnę. Porowatość filtra: 0,5 μm. Komplet jak na ilustracji.

SSI High Pressure Precolumn Filter

Wysokociśnieniowy filtr przedkolumnowy SSI

Instalacja w linii. Dysk filtra ze stali nierdzewnej 316 (pory 0,5 μm) można łatwo wymienić bez konieczności demontażu końcówki kolumny. Maksymalne ciśnienie robocze: 15 000 psi (1054 kg/cm²). Dla rurek 1/16"

Isolation Technologies Precolumn Filter

Wysokociśnieniowy filtr wstępny SSI

Umieść między pompą a wtryskiwaczem, aby zapewnić końcową filtrację fazy ruchomej. Łatwo wymienialny element filtrujący ze stali nierdzewnej 316 (pory 0,5 μm). Maksymalne ciśnienie robocze: 15 000 psi (105 MPa). Do rurek o średnicy zewnętrznej 1/16 cala, gwinty 10-32

SSI High Pressure Preinjector Filter
Technologie izolacji Filtry przedkolumnowe
Loading

Filtr przedkolumnowy Upchurch

Instalacja w linii. Korpus ze stali nierdzewnej z obojętnymi złączami końcowymi z polieteroeteroketonu (PEEK) i frytą PEEK 0,5 μm lub 2 μm w jednym złączu końcowym.

Upchurch Precolumn Filter
Filtry przedkolumnowe Upchurch
Loading

Wtryskiwacze Rheodyne Model 7725 i 7725i

Wtryskiwacz Rheodyne Model 7725 umożliwia wstrzykiwanie próbek o objętości od 1 μL do 5 ml z dokładnością i precyzją. Wytrzymała, łatwa w utrzymaniu konstrukcja oferuje wiele zaawansowanych funkcji:

  • Opatentowana, ciągła konstrukcja przepływu (patrz rysunek) - przepływ jest nieprzerwany po przełączeniu z LOAD na INJECT
  • Łatwa regulacja uszczelnienia za pomocą śruby dociskowej z przodu wtryskiwacza.
  • Szeroki kąt portu (30 °), zapewniający łatwy dostęp do złączek

Dozownik zawiera pętlę na próbkę o pojemności 20 μL i jest dostarczany z uszczelką wirnika VESPEL, którą można zastąpić uszczelką wirnika Tefzel do pracy przy pH 0-14. Fabrycznie ustawiony na 5000 psi (345 bar), regulowany do 7000 psi (483 bar). Model 7725i posiada wewnętrzny przełącznik położenia.

Konwencjonalny zawór HPLC chwilowo przerywa przepływ podczas wstrzykiwania próbki, narażając kolumnę na powtarzające się wstrząsy ciśnieniowe. Opatentowana przez Rheodyne konstrukcja MBB (make-before-break) tworzy nowe połączenie przed zerwaniem starego, zapewniając nieprzerwany przepływ.

The injector valve of a Rheodyne Model 7725 injector consists of a cylindrical body with a rotor inside. The rotor has six ports labeled from 1-6, corresponding to different sample loops or injection positions. The rotor can be rotated to align the desired port with the sample flow path. When the rotor is in position, the sample can flow through the selected port into the chromatography system.

Rheodyne Model 7725 injector. 1. To sample loop, 2 From pump, 3. MBB passage, 4. MBB port, 5. To column, 6. From sample loop

Loading

Części zamienne do pomp Optimize Technologies

Program konserwacji zapobiegawczej, który obejmuje rutynową wymianę części pompy, które ulegają zużyciu, pomoże uniknąć kosztownych przestojów. Nasz szeroki wybór zaworów zwrotnych, uszczelek i tłoków Optimize Technologies spełnia lub przewyższa specyfikacje producentów pomp. Najbardziej aktualny wybór części do pomp można znaleźć na stronie internetowej.

Optimize Technologies Pump Replacement Parts

Tłumik impulsów SSI LO-Pulse

Tłumik impulsów kontroluje pulsacje pompy, zapewniając bardziej stabilną linię bazową. Tłumik SSI LO-Pulse jest opatentowanym urządzeniem kompatybilnym z jednotłokowymi pompami tłokowymi HPLC (Altex 110A, pompy Eldex, LDC Mini-Pump VS, SSI Modele 200 i 300, itp.) Przy ciśnieniu od 500 psi do 6000 psi (35-420 kg/cm²) poprawia precyzję analiz ilościowych i limity wykrywania śladowych składników próbki. Złączki i instrukcje w zestawie.

Loading
Zaloguj się, aby kontynuować

Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.

Nie masz konta użytkownika?