Przewodnik rozwiązywania problemów HPLC

Jak identyfikować, izolować i korygować najczęstsze problemy HPLC

Chociaż opracowywanie metod HPLC zostało udoskonalone dzięki postępowi w technologii kolumn i oprzyrządowania, nadal pojawiają się problemy. Każdy poradnik dotyczący rozwiązywania problemów wspomina o powtarzalności selektywności jako najważniejszym kryterium dotyczącym kolumn, dlatego większość producentów dołożyła wszelkich starań, aby zweryfikować swoje procesy produkcyjne. Niemniej jednak, niewielkie różnice występujące w składzie chemicznym powierzchni mają tendencję do pojawiania się podczas analizy bardzo wrażliwych próbek. Praktycznie niemożliwe jest wyeliminowanie ich wszystkich podczas produkcji ze względu na zmienne: surowe materiały i odczynniki, chemię wiązań powierzchniowych, sam proces pakowania, a także paker kolumny, sprzęt laboratoryjny i środowisko. Ponadto, chemia powierzchni ma tendencję do zmiany podczas użytkowania kolumny. Faza związana ulega dezintegracji, krzemionka rozpuszcza się jako krzemian, a rozszerzona powierzchnia ma tendencję do adsorpcji zanieczyszczeń z próbki i fazy ruchomej. Dlatego te niewielkie różnice muszą być kompensowane przez wytrzymałość metody.

W tym przewodniku oferujemy systematyczne sposoby izolowania, identyfikowania i korygowania wielu typowych problemów HPLC.

Najważniejsze jest, aby pamiętać o czterech prostych głównych zasadach:

1. Zasada "jednego": nigdy nie zmieniaj więcej niż jednej rzeczy na raz. Dokonywanie kilku zmian utrudnia spekulowanie, z którego efektu zmiany wynikają.
2. Zasada "dwa": każdy efekt lub problem musi być powtarzalny, aby móc go rozwiązać. Jeśli nie można powtórzyć problemu chromatograficznego, bardzo trudno jest dowiedzieć się, co go powoduje i jak go naprawić.
3. "Odłóż to na później": w końcu często można uniknąć problemów poprzez rutynową konserwację (np. planowaną wymianę zużytych części) w regularnych odstępach czasu, prowadząc dobrą dokumentację tego, co zostało zrobione i kiedy.
4. Prowadzenie dokładnych zapisów: Większość problemów nie pojawia się z dnia na dzień, lecz rozwija się stopniowo. Dokładne prowadzenie dokumentacji jest niezbędne do wykrywania i rozwiązywania wielu problemów.
   Oceniaj każdą kolumnę, którą otrzymujesz w momencie jej otrzymania, a następnie w regularnych odstępach czasu. Prowadząc pisemną historię wydajności kolumny, używanych faz ruchomych, prądu lampy, wydajności pompy itp. można monitorować wydajność systemu.
   Zapisy pomagają również zapobiegać błędom, takim jak wprowadzanie wody do kolumny krzemionkowej lub wytrącanie buforu w systemie przez dodanie zbyt dużej ilości rozpuszczalnika organicznego. Wielu analityków w jakiś sposób modyfikuje swoje systemy HPLC. Wiarygodne zapisy są najlepszym sposobem na zapewnienie, że modyfikacja nie spowoduje problemów. W przypadku problemów związanych z pompami, detektorami, automatycznymi próbnikami i systemami danych, należy zapoznać się z instrukcją rozwiązywania problemów w podręczniku urządzenia lub skontaktować się z inżynierem serwisu urządzenia.

Ważne segmenty systemu HPLC są takie same, niezależnie od tego, czy używasz systemu modułowego, czy bardziej zaawansowanej jednostki. Problemy wpływające na ogólną wydajność systemu mogą pojawić się w każdym komponencie. Poniżej omówiono niektóre typowe problemy i kwestie, które mogą się pojawić oraz sposoby ich rozwiązywania. Chromatografowie często muszą identyfikować i rozwiązywać problemy, które można podzielić na różne kategorie. Rozwiązania tych problemów przedstawiono w łatwych w użyciu tabelach.

IZOLOWANIE PROBLEMÓW Z HPLC

W systemie HPLC problemy mogą wynikać z wielu źródeł. Najpierw należy zdefiniować problem, a następnie wyizolować jego źródło.

Określ, który komponent(y) może(mogą) powodować problemy. Proces eliminacji zazwyczaj umożliwia wskazanie konkretnej przyczyny i skorygowanie problemu.

Chcesz przenieść swoją metodę HPLC do metody UHPLC? Uzyskaj pomoc w obliczeniu czasu pracy i oszczędności zużycia rozpuszczalnika dzięki przeniesieniu metod za pomocą naszego Kalkulatora przeniesienia metody HPLC.

Figure 1. Components of an HPLC System

JAK ZAPOBIEGAĆ PROBLEMOM Z FAZĄ RUCHOMĄ

Najważniejszą częścią zestawu chromatograficznego jest kolumna. Ale nawet jeśli zapewnia ona retencję, ostateczny rozdział zależy również w dużym stopniu od fazy ruchomej (MP). Różne efekty oferowane przez fazę ruchomą wpływają na retencję i migrację różnicową (selektywność) substancji rozpuszczonych przez kolumnę. Niska czułość i rosnące linie bazowe, szumy lub skoki na chromatogramie można często przypisać zanieczyszczeniu fazy ruchomej. Zanieczyszczenia w fazie ruchomej są szczególnie kłopotliwe w przypadku elucji gradientowej, ponieważ nagromadzenie nawet niewielkich zanieczyszczeń może następować z czasem, "czekając" na zwiększoną moc elucyjną fazy ruchomej. Linia bazowa może wzrosnąć, a fałszywe piki mogą pojawić się wraz ze wzrostem poziomu zanieczyszczonego składnika.

Często problemy z rozdzielaniem chromatograficznym są związane z nieprawidłowo/niekonsekwentnie przygotowaną fazą ruchomą. W związku z tym można zaobserwować tendencję do stosowania prostszych faz ruchomych ze względów praktycznych, takich jak zwiększona niezawodność metody, łatwiejszy transfer metody i łatwość użycia (np. w diagnostyce klinicznej lub kontroli procesu).

Czystość dodatku rozpuszczalnika/fazy ruchomej

Większość z Was zna zasadę: "garbage in, garbage out." To powiedzenie jest szczególnie prawdziwe przy wyborze odpowiedniej czystości składników fazy ruchomej. Na przykład, absolutną koniecznością jest stosowanie rozpuszczalników i odczynników klasy gradientowej do separacji gradientowej w celu uzyskania dokładnej, powtarzalnej i czystej linii bazowej (wolnej od pików widmowych) oraz czułej separacji chromatograficznej. Używanie właściwej i odpowiedniej klasy rozpuszczalników w oparciu o metodę aplikacji (np, hypergrade dla LC-MS, zobacz więcej na SigmaAldrich.com/solvents)  minimalizuje również ryzyko zanieczyszczenia i wydłuża żywotność kolumny chromatograficznej.

Woda jest najczęstszym źródłem zanieczyszczeń w analizach z odwróconą fazą. Należy używać wyłącznie wody o wysokiej czystości, klasy HPLC lub LC-MS, w zależności od analiz. Może to być dostępna w handlu woda butelkowana lub ultraczysta woda z odpowiedniego systemu oczyszczania wody Milli-Q^®. Systemy Ultrapure Milli-Q^® są doskonałym wyborem dla chromatografów, ponieważ oferują unikalne połączenie zoptymalizowanego oczyszczania wody, w tym filtr końcowy zawierający krzemionkę C18 w odwróconej fazie, oraz technologie monitorowania. Wybór optymalnego systemu wody ultraczystej (typu 1) dla danego laboratorium będzie zależał od kilku parametrów, takich jak: dostępna jakość wody zasilającej, dzienne zapotrzebowanie na objętość, wymagania dotyczące monitorowania, oczekiwane poziomy certyfikacji i wszelkie inne specyficzne wymagania. Jeśli używasz wody destylowanej lub dejonizowanej (DI), pamiętaj, że popularne dejonizatory mogą wprowadzać zanieczyszczenia organiczne do wody, narażając analizy na ryzyko.

Używaj tylko rozpuszczalników klasy HPLC (lub LC-MS), soli, odczynników par jonowych oraz modyfikatorów zasad i kwasów. Czyszczenie rozpuszczalników niższej jakości jest czasochłonne i często pozostają w nich śladowe ilości zanieczyszczeń. Te śladowe zanieczyszczenia mogą powodować problemy podczas korzystania z detektora ultrafioletu, fluorescencji lub spektrometrii mas (MS) o wysokiej czułości. Jeśli używasz spektrometrii mas jako detektora końcowego, użyj rozpuszczalników i dodatków klasy MS, aby zapewnić najwyższą ogólną czułość metody i uniknąć zanieczyszczenia instrumentu MS.

Ponieważ wiele buforów wodnych sprzyja rozwojowi bakterii lub glonów, należy przygotować te roztwory świeże i przefiltrować je za pomocą filtra membranowego 0,22 μm, jeśli wykonujesz analizę UHPLC lub filtra 0,45 μm do standardowej analizy HPLC przed użyciem. Filtrowanie usunie również cząstki, które mogą powodować zakłócenia linii bazowej lub zatkać kolumnę. Zapobieganie rozwojowi mikroorganizmów poprzez dodanie około 100 ppm azydku sodu do buforów wodnych. Alternatywnie, bufory te można również zmieszać z 20% lub więcej rozpuszczalnika organicznego, takiego jak etanol, acetonitryl, metanol lub izopropanol.

W przypadkach wymagających dodania dowolnego odczynnika, takiego jak bufor, należy upewnić się, że odczynnik spełnia wymaganą jakość i nie upłynął jego termin ważności. Degradanty z przeterminowanych dodatków prowadzą do pików widmowych na chromatogramach próbek. Niektóre dodatki ulegają degradacji szybciej, w zależności od ich charakteru (na przykład bufor fosforanowy 20 mM, pH 7). Niewłaściwe/nieostrożne obchodzenie się z tymi odczynnikami (np. wlewanie resztek rozpuszczalnika z powrotem do butelki, pozostawienie butelki na stole laboratoryjnym bez zakrętki, zgubienie końcówek pipet pływających wewnątrz butelki itp.

Mieszanie faz ruchomych

W przypadku separacji izokratycznych z użyciem wstępnie zmieszanych faz ruchomych, podczas ich przygotowywania należy wziąć pod uwagę skurcz objętościowy rozpuszczalnika w powszechnie stosowanych mieszaninach (woda/acetonitryl, metanol lub tetrahydrofuran). Jedynym prawidłowym sposobem przygotowania takich mieszanin faz ruchomych jest oddzielne pobranie dokładnie odmierzonych objętości składników i zmieszanie ich. Na przykład, aby uzyskać 70% organiczną fazę ruchomą, 300 ml wody i 700 ml rozpuszczalnika organicznego należy dokładnie odmierzyć oddzielnie, a następnie połączyć w kolbie. Ale jeśli tylko woda zostanie dokładnie odmierzona, a następnie rozpuszczalnik organiczny zostanie dodany w celu uzupełnienia wymaganej objętości końcowej, ze względu na kurczenie się mieszaniny rozpuszczalników, wynikowa moc rozpuszczalnika będzie nieco wyższa (lub słabsza w przypadku, gdy rozpuszczalnik organiczny został dodany jako pierwszy, a woda została dodana później). W przypadku wstępnego mieszania MP należy zwrócić uwagę na toksyczne opary rozpuszczalnika, które mogą być emitowane pod wyciągiem.

Obecnie gradienty są generalnie prawidłowo formułowane przy użyciu pomp gradientowych; jednak pewne niewielkie różnice w zachowaniu retencji można zaobserwować podczas porównywania instrumentów z niskociśnieniowymi i wysokociśnieniowymi systemami gradientowymi ze względu na ich mechanizmy mieszania. Oba podejścia mają wady i zalety - aparaty do formowania gradientowego pod niskim ciśnieniem są prostsze, a zatem łatwiejsze w utrzymaniu, ale ich główną zaletą jest stały przepływ niezależny od gradientu. Przepływ uzyskany z systemów formowania gradientowego pod wysokim ciśnieniem jest o kilka procent niższy, ze względu na kurczenie się rozpuszczalnika po zmieszaniu. Zjawisko to należy mieć na uwadze, jeśli ktoś przenosi ustaloną metodę z jednego typu urządzenia na drugie.

W chromatografii z odwróconymi fazami w większości przypadków lepiej jest pracować z wstępnie zmieszanymi fazami ruchomymi, takimi jak 5% acetonitrylu w wodzie i/lub 5% wody w acetonitrylu. Uzasadnieniem takich preferencji jest zwiększenie skuteczności odgazowywania, uniknięcie ogrzewania mieszaniny (np. metanolu w wodzie) lub chłodzenia (np. acetonitrylu w wodzie) podczas mieszania, a także poprawa wydajności mieszania poprzez upodobnienie dwóch faz ruchomych pod względem lepkości i napięcia powierzchniowego. Ograniczenia takich wstępnie zmieszanych rozpuszczalników polegają na tym, że moc rozpuszczalnika fazy ruchomej B nie może wynosić 100% i że jest to dodatkowy krok w przygotowaniu fazy ruchomej - co jest dodatkowym, potencjalnym źródłem błędu. Zazwyczaj zaleca się stosowanie rozpuszczalników fazy ruchomej bezpośrednio z ich pojemników dostawczych, aby zapobiec dodatkowym szansom na zanieczyszczenie.

Podczas analizy próbek zawierających związki jonizowalne, bufor może być jedną z najważniejszych zmiennych kontrolujących retencję w separacji HPLC. pH fazy ruchomej określa obecność jonizowalnych związków (analitów i matrycy) w stanie zjonizowanym lub niezjonizowanym. Gatunki zjonizowane w chromatografii w fazie odwróconej (RP) zawsze eluują z kolumny wcześniej niż gatunki niezjonizowane. Zmiana pH może również zwiększyć selektywność skutecznej separacji blisko eluujących lub nakładających się pików. Zmienność pH między seriami powoduje niespójność separacji. Bufory zapobiegają zmianom pH. Dlatego właściwy wybór buforu, pod względem gatunków buforujących, siły jonowej i pH, jest najbardziej krytycznym krokiem w opracowywaniu metody HPLC, gdy analizowane są substancje jonizowalne.

Wskazówki dotyczące wyboru buforu LC

Wybór buforu. Wybór odpowiedniego buforu do danego zastosowania zależy od właściwości buforu, takich jak pKa, zakres pH i odcięcie UV. Zasadniczo bufory powinny być używane dla pH w zakresie +/- 1 jednostki ich wartości pKa. W tym zakresie bufory są odporne na wszelkie celowe próby zmiany pH. Pojemność buforu jest maksymalna, gdy pH buforu jest równe jego pKa. Należy również wziąć pod uwagę wartość odcięcia UV, ponieważ długość fali wykrywania nie powinna zakłócać absorbancji buforu (znacząca absorbancja: kwas trifluorooctowy < 220 nm; kwas mrówkowy, kwas octowy < 240 nm). Aby uzyskać najlepsze wyniki z jonizowalnym analitem będącym przedmiotem zainteresowania, należy użyć buforu o pH co najmniej 2 jednostki od pKa. Jeśli pH fazy ruchomej jest zbyt zbliżone do pKa analitu, można zaobserwować rozdzielone piki lub ramiona z powodu obecności obu gatunków w próbce. W przypadku kilku jonizowalnych analitów, preferowane jest wybranie wartości pH, przy której wszystkie anality występują w tej samej formie, zjonizowanej lub niezjonizowanej.

• Pomiar pH buforu. pH buforu to pH części wodnej przed dodaniem organicznej fazy ruchomej. Dodanie rozpuszczalnika organicznego zwykle przesuwa pH w górę lub w dół (przesunięcie pH powinno być stałe dla tego samego buforu). Nie jest tak ważne, aby znać dokładną wartość pH buforu w środowisku organicznym, ale ważne jest, aby mieć spójną wartość pH (ponieważ pKa analitów jest również określane w fazie wodnej, a my również nie znamy indywidualnych przesunięć pKa).
• Chemical Purity. Jakość/czystość dodatków do fazy ruchomej (buforów, soli, kwasów i zasad) wraz z rozpuszczalnikami organicznymi wykorzystywanymi w eksperymencie HPLC musi być dostosowana do czułości detektora i protokołu elucji.
• Kompatybilność chemiczna. Skład buforu, wraz z pH fazy ruchomej, musi być dobrany w porozumieniu z materiałem obudowy kolumny i charakterem fazy stacjonarnej, aby zapobiec ich korozji.
• Kompatybilność MS. Nie zaleca się wprowadzania soli mineralnych do systemu spektrometrii mas. Przykładami odpowiednich buforów lotnych są octan amonu, mrówczan amonu i cytrynian amonu. Modyfikatory pH, takie jak kwas mrówkowy i kwas octowy, powinny być stosowane do kontrolowania pH i wspomagania jonizacji w LC-MS.
• Rozpuszczalność buforu. W idealnym przypadku bufor powinien być całkowicie rozpuszczalny w wodzie (metody RP) i nie powinien wytrącać się podczas analizy po zmieszaniu z wybranym rozpuszczalnikiem organicznym. Stężenie buforu musi być zatem starannie dobrane, aby uniknąć wytrącania przy wyższych stężeniach w rozpuszczalniku organicznym. Jeśli zostanie to zaniedbane, może to spowodować problemy operacyjne z pompami i wywołać zablokowanie kolumny HPLC lub wzrost ciśnienia wstecznego.
• Siła buforu. Eluent wykazujący słabe oddziaływanie z fazą stacjonarną jest w stanie eluować tylko słabo związane anality z kolumny, podczas gdy silne oddziaływanie powoduje elucję silnie związanych cząsteczek próbki. Siła elucji lub rozpuszczania różnych rozpuszczalników zależy od rodzaju zastosowanej fazy stacjonarnej. Po sile elucji, lepkość buforu odgrywa ważną rolę pod względem jego przydatności do stosowania w analizach HPLC.
• Stężenie buforu. Najlepiej jest wybrać najniższe stężenie, które daje powtarzalne wyniki. Wyższe stężenia prowadzą do szybszej elucji cząsteczek polarnych. Ogólnie, stężenie buforu nie powinno być niższe niż 5 mM. Poniżej tego stężenia bufor może nie działać jako bufor (zależy to od stężenia analitu i zdolności buforowania). Zwiększenie stężenia buforu może zwiększyć lepkość, co z kolei może zwiększyć przeciwciśnienie w kolumnie. Zazwyczaj stężenie powinno być utrzymywane w zakresie od 5 do 100 mM. Stężenie buforów soli mineralnych wyższe niż 100 mM powoduje szybsze zużycie ruchomych części pompy, dlatego zaleca się zainstalowanie płukania wstecznego.

Można zauważyć, że bufory odgrywają kluczową rolę w większości separacji HPLC. Rozwój metod często wymaga starannego doboru buforów i odpowiedniej staranności w ich przygotowaniu. Tak więc, ogólne zasady, o których należy pamiętać to - roztwory buforowe muszą być jednorodne, klarowne i wolne od jakichkolwiek cząstek. W przypadku przechowywania należy pamiętać, że bufory mają ograniczoną żywotność, dlatego należy je przygotowywać codziennie.

Odgazowanie fazy ruchomej

Odgazowanie fazy ruchomej w chromatografii ma ogromne znaczenie dla uzyskania dokładnych i powtarzalnych wyników. Odgazowanie fazy ruchomej polega na usunięciu rozpuszczonych gazów, w szczególności tlenu i dwutlenku węgla, które mogą niekorzystnie wpływać na wydajność systemu chromatograficznego. Obecność tych gazów może prowadzić do niestabilności linii bazowej, szumów detektora i zmian czasów retencji, z których wszystkie mogą zagrozić wiarygodności danych chromatograficznych. Ponadto odgazowanie pomaga zapobiegać tworzeniu się pęcherzyków gazu w pompie i kolumnie chromatograficznej, co może wpływać na precyzję dostarczania eluentu i powodować wahania natężenia przepływu. Konsekwentne i wydajne odgazowywanie jest szczególnie istotne w systemach wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), gdzie precyzyjne i stabilne warunki są niezbędne do uzyskania dokładnych kształtów pików i rozdzielczości. Ogólnie rzecz biorąc, odgazowanie fazy ruchomej jest niezbędnym krokiem w metodologii chromatograficznej, zapewniającym powtarzalność i dokładność wyników analitycznych oraz utrzymującym solidność systemu chromatograficznego. Aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków w systemie, należy dokładnie odgazować fazę ruchomą. Ogólnie rzecz biorąc, odgazowywacz in-line jest pierwszym i najlepszym wyborem (tani i skuteczny), ale sonikacja (łatwe, ale niekompletne odgazowanie) lub rozpylanie helem (bardzo skuteczne, ale drogie) może być alternatywą, jeśli faza ruchoma nie zawiera żadnych lotnych składników. Niska temperatura zwiększa rozpuszczalność gazów, dlatego rozpuszczalniki przechowywane w lodówce należy ustabilizować do temperatury pokojowej lub dodatkowo odgazować za pomocą innych metod (na przykład sonikacji) przed wprowadzeniem do systemu polegającego na odgazowaniu próżniowym online.

IZOLOWANIE PROBLEMÓW Z POMPĄ

Pompa musi zapewniać stały przepływ rozpuszczalnika do kolumny w szerokim zakresie warunków. Pompy HPLC zawierają pojedyncze lub podwójne tłoki, strzykawki lub pompy membranowe. Pompy te mogą być nisko- lub wysokociśnieniowymi systemami gradientowymi (Rysunki 2 & 3). Oba podejścia są stosowane, jednak wysokociśnieniowa pompa gradientowa może dostarczać natężenie przepływu do 4% niższe niż ustawiona wartość z powodu skurczu rozpuszczalnika po wymieszaniu, potencjalnie wpływając na precyzję separacji chromatograficznych. Z drugiej strony, niskociśnieniowa pompa gradientowa opóźnia dotarcie gradientu do kolumny, wprowadzając wyzwania w utrzymaniu precyzyjnych warunków elucji, szczególnie wyraźne przy użyciu stromych gradientów o dużej prędkości. Te cechy operacyjne należy dokładnie rozważyć przy wyborze systemu pompy w oparciu o specyficzne wymagania analizy chromatograficznej, szczególnie przy przenoszeniu metody z jednego urządzenia do drugiego.

Figure 2 High-pressure gradient system

Figure 3. Low-pressure gradient system

 

Problemy z pompami chromatograficznymi mogą obejmować różne kwestie, które mogą wpływać na wydajność i niezawodność pompy w chromatografii. 

>

Problemy z pompą chromatograficzną	Przyczyna/(y)
Hałas bazowy	Zanieczyszczenia lub pęcherzyki powietrza w fazie ruchomej, zużyte uszczelki pompy lub problemy z zaworami zwrotnymi.
Wahania natężenia przepływu	Nieprawidłowości w elementach pompy, takich jak tłoki, uszczelki lub zawory zwrotne.
Dokładność gradientu	Nieprawidłowe działanie pompy lub nieprawidłowe programowanie .
Nieszczelność	Zużyte uszczelki, zbyt wysokie ciśnienie wsteczne, luźne połączenia lub uszkodzone przewody.
Wahania ciśnienia	Nieprawidłowe działanie pompy, pęcherzyki powietrza w fazie ruchomej lub problemy z zaworami zwrotnymi.
Loss of Prime	Powietrze w głowicy pompy, nieszczelności lub niewystarczający poziom rozpuszczalnika.
Pogorszenie stanu uszczelnienia pompy	Ciągłe użytkowanie, agresywne rozpuszczalniki lub niewłaściwa konserwacja. Zaleca się zainstalowanie płukania wstecznego uszczelnienia podczas pracy z fazami ruchomymi zawierającymi sól.
Niespójne pompowanie	Nieprawidłowości w elementach pompy, takie jak zużyte tłoki lub nieprawidłowo działające zawory zwrotne.
Skoki ciśnienia	Problemy z komponentami pompy lub obecność pęcherzyków powietrza w systemie.
Kwestie kontroli temperatury	Niewłaściwe mechanizmy kontroli temperatury mogą prowadzić do zmian lepkości rozpuszczalnika, wpływając na wydajność pompy.

Rozwiązanie tych problemów często wymaga rutynowej konserwacji, sprawdzania i wymiany materiałów eksploatacyjnych oraz zapewnienia prawidłowej kalibracji i działania pompy chromatograficznej. Regularne kontrole systemu i przestrzeganie zalecanych harmonogramów konserwacji są niezbędne do uzyskania optymalnej wydajności chromatograficznej.

Problemy z systemem pompowania są zazwyczaj łatwe do wykrycia i skorygowania. Cechą charakterystyczną problemów z układem pompowym jest powtarzający się hałas bazowy, którego częstotliwość wzrasta proporcjonalnie do natężenia przepływu. Pewnym znakiem nieszczelności jest nagromadzenie soli na połączeniu pompy. Sole buforowe powinny być codziennie wypłukiwane z systemu za pomocą świeżej, dejonizowanej wody. Aby wyizolować i naprawić określone problemy związane z urządzeniem, należy skorzystać z sekcji rozwiązywania problemów i konserwacji w instrukcji obsługi lub skontaktować się z dostawcą urządzenia. Uszczelki pompy wymagają okresowej wymiany. Program konserwacji zapobiegawczej jest wysoce zalecany przy zakupie nowego systemu (U)HPLC.

WTRYSKIWACZ I ROZPUSZCZALNIKI WTRYSKOWE

Wtryskiwacz szybko wprowadza próbkę do systemu przy minimalnym zakłóceniu przepływu rozpuszczalnika. Systemy HPLC wykorzystują obecnie wtryskiwacze o zmiennej pętli, stałej pętli i strzykawkowe. Te konfiguracje są aktywowane ręcznie, pneumatycznie lub elektrycznie.

Problemy mechaniczne związane z wtryskiwaczem (np. wycieki, zatkane rurki kapilarne, zużyte uszczelki) są łatwe do wykrycia, a ich korygowanie wiąże się z rozwiązywaniem różnych kwestii, które mogą mieć wpływ na jakość i powtarzalność wyników chromatograficznych. Użyj filtra przedkolumnowego, aby zapobiec zatykaniu się fryty kolumny z powodu fizycznej degradacji uszczelki wtryskiwacza. Inne problemy, takie jak niereprodukowalne iniekcje, są trudniejsze do rozwiązania.

Zmienne wysokości pików, rozszczepione piki i szerokie piki mogą być spowodowane niekompletnie wypełnionymi pętlami próbek, niezgodnością rozpuszczalnika iniekcyjnego z fazą ruchomą lub słabą rozpuszczalnością próbki. W miarę możliwości należy rozpuszczać i wstrzykiwać próbki w fazie ruchomej, która przepływa przez kolumnę w momencie wstrzyknięcia. W przeciwnym razie należy upewnić się, że rozpuszczalnik iniekcyjny ma mniejszą siłę eluotropową niż faza ruchoma. Należy pamiętać, że niektóre autosamplery używają oddzielnych roztworów do płukania strzykawek. Należy upewnić się, że roztwór płuczący jest kompatybilny i słabszy niż faza ruchoma. Fakt ten jest szczególnie ważny podczas przełączania między fazą odwróconą i normalną lub analizami chromatografii cieczowej z interakcją hydrofilową (HILIC). Zapewnienie czystości zewnętrznej powierzchni igły iniekcyjnej ma również kluczowe znaczenie, szczególnie w przypadku próbek o wysokim stężeniu lub lepkości. Zewnętrzne mycie igły jest zalecane, aby zapobiec wszelkim pozostałościom po poprzednich wstrzyknięciach i uniknąć zanieczyszczenia portu zestawu igły iniekcyjnej, co mogłoby zagrozić dokładności kolejnych analiz i spowodować zanieczyszczenie krzyżowe między różnymi próbkami. Można to osiągnąć poprzez zanurzenie igły w jednej lub kilku fiolkach zawierających roztwory myjące przeznaczone do dokładnego czyszczenia zewnętrznej części igły. Właściwe mycie zewnętrzne nie tylko pomaga utrzymać integralność systemu chromatograficznego, ale ostatecznie przyczynia się do precyzji i wiarygodności wyników analitycznych.

Właściwe przygotowanie próbki jest krytycznym aspektem zapewnienia dokładności i wiarygodności analiz chromatograficznych. Konieczne jest filtrowanie próbek przed wstrzyknięciem, aby zapobiec potencjalnemu zatkaniu igły wtryskiwacza i późniejszym problemom z systemem. Filtrowanie usuwa cząstki stałe, które mogą blokować wąskie kanały igły iniekcyjnej, zapewniając płynny i spójny proces iniekcji. Ponadto podczas pobierania próbek z fiolek zaleca się unikanie wstrzykiwania z dna fiolki, ponieważ z czasem może gromadzić się osad. Sedymentacja może prowadzić do wprowadzenia niepożądanych cząstek do układu chromatograficznego, zatykając/zanieczyszczając kolumnę. Przestrzegając najlepszych praktyk, takich jak filtrowanie próbek i unikanie wstrzykiwania z dna fiolki, analitycy przyczyniają się do ogólnej wiarygodności i precyzji wyników chromatograficznych, minimalizując ryzyko zanieczyszczenia systemu i zapewniając optymalną wydajność.

OCHRONA KOLUMNY

Filtry wlotowe fazy ruchomej, filtry przed wstrzykiwaczem i przed kolumną oraz kolumny ochronne, choć nie stanowią integralnej części większości urządzeń, znacznie zmniejszają problemy związane ze złożonymi separacjami. Zalecamy filtrowanie wszystkich próbek przez filtry strzykawkowe 0,45 μm lub 0,2 μm.

Filtry wewnętrzne odgrywają kluczową rolę w systemach chromatograficznych, służąc jako niezbędne elementy poprawiające jakość i trwałość kolumn analitycznych. Umieszczone strategicznie w ścieżce płynu, filtry te skutecznie wychwytują cząstki stałe, zanieczyszczenia lub zanieczyszczenia obecne w fazie ruchomej lub próbce, zanim dotrą do kolumny chromatograficznej. Zapobiegając przedostawaniu się niepożądanych cząstek, filtry inline przyczyniają się do ochrony i zachowania materiału wypełnienia kolumny, wydłużając w ten sposób jej żywotność i zapewniając spójne i powtarzalne separacje. Filtry inline nie mają na celu zastąpienia filtracji, ale są raczej dodatkowym zabezpieczeniem kolumny. Zaleca się, aby porowatość filtrów liniowych była mniejsza niż fryty wlotowej kolumny. Na przykład, fryta na głowicy kolumny wypełniona cząstkami o wielkości 5 µm wynosi 2 µm, w tym przypadku porowatość filtra inline powinna wynosić ~1-0,5 µm. Gdy ciśnienie wsteczne w systemie zacznie rosnąć, należy sprawdzić i w razie potrzeby wymienić filtr liniowy.

We wszystkich przypadkach zdecydowanie zalecamy stosowanie kolumn ochronnych. Faza stacjonarna w kolumnie ochronnej powinna być dopasowana do kolumny analitycznej, tak aby wychwytywała substancje, które nieodwracalnie zaadsorbowałyby się na kolumnie analitycznej, ograniczając jej żywotność. Kolumna ochronna działa jak element ofiarny w systemie chromatograficznym. Żywotność tych jednorazowych produktów zależy od składu fazy ruchomej, objętości wtrysku, czystości próbki, pH itp. Gdy urządzenia te ulegają zanieczyszczeniu lub zatkaniu cząstkami, wzrasta ciśnienie, a piki poszerzają się lub rozdzielają. 

JAK NAJLEPSZE WYKORZYSTANIE KOLUMNY ANALITYCZNEJ

Niezależnie od tego, czy kolumna zawiera fazę odwróconą lub normalną, wymianę jonową, powinowactwo, oddziaływanie hydrofobowe, wykluczenie wielkości lub wypełnienie na bazie żywicy/krzemionki, najczęstszym problemem związanym z kolumnami analitycznymi jest pogorszenie jakości. Objawy pogorszenia jakości to słaby kształt piku, rozszczepione piki, ramiona, utrata rozdzielczości, skrócone czasy retencji i wysokie ciśnienie wsteczne. Objawy te wskazują, że zanieczyszczenia nagromadziły się na frycie lub wlocie kolumny, lub że w złożu znajdują się puste przestrzenie, kanały lub zagłębienia.

Pogorszenie jakości jest bardziej widoczne w kolumnach o wyższej wydajności. Na przykład, wypełnienie o grubości 3,0 µm zatrzymywane przez frytę o grubości 0,5 µm jest bardziej podatne na zatykanie niż wypełnienie o grubości 5 lub 10 µm zatrzymywane przez frytę o grubości 2,0 µm lub większą. Właściwa ochrona kolumny i przygotowanie próbki są niezbędne, aby w pełni wykorzystać możliwości każdej kolumny.

Przeciążenie kolumny może powodować słabe kształty pików i inne problemy.

Przeciążenie kolumny może powodować słabe kształty pików i inne problemy.

TYPOWA POJEMNOŚĆ KOLUMNY (ładowanie, wstrzykiwanie próbki)

Pojemność kolumny zależy od wielu czynników, ale typowe wartości dla całkowitej maksymalnej objętości wtrysku i ilości próbek analitów na kolumnie podano w poniższej tabeli. Za maksymalną objętość wtrysku uważa się nie więcej niż 2% całkowitej objętości kolumny, a typowe stężenie próbki w HPLC wynosi około 1 mg/ml. Należy pamiętać, że wydajność i rozdzielczość zwykle zwiększają się wraz ze zmniejszeniem objętości wtrysku.

Wymiar kolumny Długość x śr. wew. (mm)	Typowe prędkości przepływu*	Maks. ilość próbki**	Objętość próbki***
100 x 0.075	0.15 - 0,5 µL/min	9 ng	0.5 - 9 nL
100 x 0.1	0.25 - 1 µL/min	16 ng	1 - 16 nL
100 x 0.2	1 - 4 µL/min	60 ng	0.01 - 0.06 μL
100 x 0.3	2 - 9 µL/min	140 ng	0.01 - 0.14 μL
100 x 0.5	5 - 25 µL/min	0.4 µg	0.05 - 0.4 μL
100 x 1	20 - 100 µL/min	2 µg	0.1 - 2 μL
100 x 1.5	0.04 - 0.2 mL/min	4 µg	0.2 - 4 μL
100 x 2	0.08 - 0.4 mL/min	6 µg	0.4 - 6 μL
250 x 3	0.15 - 0.8 mL/min	40 µg	3 - 40 μgL
250 x 4	0.3 - 1.5 mL/min	60 µg	4 - 60 μL
250 x 4.6	0.4 - 2 mL/min	80 µg	5 - 80 μL
250 x 10	2 - 10 mL/min	400 µg	30 - 400 μL
250 x 25	10 - 60 ml/min	2.5 mg	200 - 2500 μL
* Typowe wartości natężenia przepływu obliczone dla w pełni porowatej kolumny z cząsteczkami 5 µm, dla kolumn z mniejszymi cząsteczkami, natężenia przepływu są wyższe o współczynnik 1.6 przy przejściu z cząstek o wielkości 5 do 3 µm i o współczynnik 2,5 przy przejściu z cząstek o wielkości 5 do 2 µm. W przypadku materiałów powierzchniowo porowatych górna granica natężenia przepływu jest również wyższa w porównaniu do cząstek w pełni porowatych. W przypadku monolitycznych kolumn krzemionkowych górna granica natężenia przepływu może być nawet 3 razy wyższa. Uwaga: w każdym przypadku ważne jest, aby monitorować przeciwciśnienie w kolumnie i nie przekraczać maksymalnych zalecanych limitów. ** Jeśli na kolumnę trzeba załadować dużą ilość próbki, lepiej jest zwiększyć stężenie próbki niż jej objętość. Standardowe stężenie próbki w HPLC/UHPLC wynosi 1 mg/ml. *** Maksymalne objętości wtrysku są obliczane na podstawie maksymalnego zalecanego limitu objętości, który wynosi 2% objętości pustej kolumny. W przypadku powierzchniowo porowatych cząstek i monolitycznych kolumn krzemionkowych maksymalna objętość wstrzyknięcia powinna zostać zmniejszona o 50%.

ROZWIĄZYWANIE PROBLEMÓW Z DETEKTORAMI

Problemy z detektorami dzielą się na dwie kategorie - elektryczne i mechaniczne/optyczne. W przypadku problemów elektrycznych należy skontaktować się z producentem urządzenia. Problemy mechaniczne lub optyczne zwykle można przypisać do celi pomiarowej. Problemy z detektorami obejmują zanieczyszczenie celi, pęcherzyki powietrza i wycieki. Powodują one zazwyczaj niską czułość, dryfty, dźwięki linii bazowej lub skoki na chromatogramach. Niektóre komórki są wrażliwe na ciśnienie, szczególnie te znajdujące się w detektorach współczynnika załamania światła. Natężenia przepływu lub ciśnienia wsteczne przekraczające zalecenia producenta spowodują pęknięcie okna komórki. Stare lub uszkodzone lampy, a także nieprawidłowy czas narastania, wzmocnienie lub tłumienie detektora zmniejszają czułość i wysokość piku.

HPLC PROBLEMY, PRZYCZYNY I ŚRODKI ZARADCZE

Retencja

Niewielkie różnice w składzie fazy ruchomej mogą powodować ogromne różnice w czasie retencji, gdy kolumna jest przeciążona, a to również zmienia się wraz z temperaturą. Jednak nawet jeśli faza ruchoma jest buforowana, a pompa działa prawidłowo, czasy retencji mogą się wahać, jeśli pH jest zbyt zbliżone do pK substancji próbki. Dlatego pH fazy ruchomej powinno być dobrane tak, aby było co najmniej o jedną jednostkę pH powyżej lub poniżej wartości pK rozdzielanych analitów. Dryf czasu retencji wskazuje na niewystarczające kondycjonowanie kolumny. Wraz ze wzrostem żywotności kolumny, czasy retencji mogą przesuwać się w kierunku mniejszej retencji, zwłaszcza jeśli użytkownik pracuje przy kwaśnym pH (≤pH 2). Nagłe zmiany czasu retencji są zwykle spowodowane błędami w systemie.

Problem: zmieniające się czasy retencji

Figure 4. Variable Retention Times. A) Normal, B) Problem, C) Problem

Możliwa przyczyna	Rozwiązanie
Flow rate variation	Usuń nieszczelności systemu Wymień uszczelki pompy Usuń pęcherzyki powietrza Sprawdź, czy nie ma kawitacji
Niewystarczająca pojemność bufora	Użyj stężenia buforu >20 mM i <50 mM
	Zanieczyszczenie kolumny                                                      nbsp;	Od czasu do czasu przepłukać kolumnę silnym rozpuszczalnikiem lub zregenerować kolumnę<
Czas wyrównania niewystarczający dla przebiegu gradientowego lub zmiany izokratycznej fazy ruchomej	Pozwolić na przejście co najmniej 10 objętości przez kolumnę w celu regeneracji gradientu lub po zmianie rozpuszczalnika. Prawdziwą równowagę osiąga się po 30 objętościach kolumny
.Kilka pierwszych wstrzyknięć - miejsca aktywne                                     &	Kondycjonowanie kolumny poprzez wstrzyknięcie stężonej próbki Niespójne mieszanie fazy ruchomej w trybie on-line Sprawdź, czy system gradientu dostarcza stały skład Porównaj z ręcznie przygotowaną fazą ruchomą Częściowo wstępnie wymieszaj fazę ruchomą. Unikaj pracy od 100% czystego rozpuszczalnika do 100% wodnego
Selektywne odparowanie składnika fazy ruchomej	Używaj zamkniętych zbiorników rozpuszczalnika Używaj mniej energicznego oczyszczania Przygotuj świeżą fazę ruchomą Sprawdź pompę Sprawdź frytę Unikaj parowania lub degradacji fazy ruchomej
Column temperature variation         &                                            &	Termostat lub izolacja kolumny Użyj pieca kolumnowego Zapewnij stałą temperaturę laboratoryjną
Przeciążenie kolumny. (Czasy retencji zwykle zmniejszają się, gdy masa substancji rozpuszczonej wstrzykniętej na kolumnę przekracza pojemność kolumny)	Wstrzyknij mniejszą objętość (np, 10 μL vs. 100 μL) lub wstrzyknąć taką samą objętość po rozcieńczeniu próbki 1:10 lub 1:100 rozcieńczenia próbki
Sample solvent incompatible with mobile phase	Dostosuj rozpuszczalnik. Jeśli to możliwe, wstrzykiwać próbki w fazie ruchomej
.Starzenie kolumny	Wymień kolumnę Jeśli starzenie jest przedwczesne, może pochodzić z matrycy próbki. Wykonaj regenerację kolumny Użyj kolumny ochronnej

Problem: skracający się czas retencji

Możliwa przyczyna	Rozwiązanie
Aktywne strony przy pakowaniu kolumn	Użyj modyfikatora fazy ruchomej Kompetencyjna zasada (związki zasadowe) lub zwiększ moc buforu Użyj upakowania kolumny o wyższym pokryciu
Przeciążenie masowe kolumny	Zmniejsz ilość próbki lub użyj kolumny o większej średnicy
Zwiększenie natężenia przepływu	Sprawdź i zresetuj natężenie przepływu pompy
Utrata związanej fazy stacjonarnej	Używaj pH fazy ruchomej, które mieści się w specyfikacji podanej dla danej kolumny (zwykle między pH 2 i pH 7.5) z Purospher® STAR pH 1,5-10.5
Zmiany temperatury kolumny	Termostat lub izolacja kolumny Termostat lub izolacja kolumny Użyj pieca kolumnowego Zapewnij stałą temperaturę laboratoryjną
Zmiana składu fazy ruchomej	Sprawdzić pompę Sprawdzić fryturę Unikać parowania lub degradacji fazy ruchomej
Zanieczyszczenie kolumny	Faza stacjonarna zmodyfikowana przez próbkę. Zregeneruj lub zmień kolumnę

Problem: wydłużenie czasu retencji

Możliwa przyczyna	Rozwiązanie
Zmniejszające się natężenie przepływu	Sprawdź i zresetuj natężenie przepływu pompy Sprawdzić, czy nie ma kawitacji pompy Sprawdzić, czy nie ma nieszczelnych uszczelek pompy i/lub innych nieszczelności w układzie
Zmiana składu fazy ruchomej	Przykryć zbiorniki rozpuszczalnika Upewnić się, że system gradientowy dostarcza prawidłowy skład .
Utrata związanej fazy stacjonarnej	Używaj pH fazy ruchomej, które mieści się w specyfikacji podanej dla danej kolumny (zwykle między pH 2 i pH 7.5) W przypadku Purospher® STAR pH 1.5-10.5
Zmiana składu fazy ruchomej - mieszanie online	Sprawdzić pompę Sprawdzić fryturę Unikać parowania lub degradacji fazy ruchomej
Niedostateczna lub niewystarczająca kontrola pH dla związków jonowych	Używaj buforowanych faz ruchomych Zwiększyć stężenie buforu Użyć buforu bardziej odpowiedniego dla wymaganego zakresu pH
Zmniejszenie temperatury / Zmiany temperatury w kolumnie	Używaj termostatu kolumnowego
. Zanieczyszczenie kolumny	Faza stacjonarna zmodyfikowana przez próbkę. Zregeneruj lub zmień kolumnę

Equlibration

Równoważenie kolumny chromatograficznej jest kluczowym etapem procesu chromatograficznego, niezbędnym do zapewnienia dokładnych i powtarzalnych wyników. Proces ten polega na umożliwieniu przepływu fazy ruchomej przez kolumnę w określonych warunkach, aż do osiągnięcia stabilnej linii bazowej, wskazującej, że system jest w równowadze.

Equilibration służy kilku ważnym celom. Po pierwsze, pozwala fazie stacjonarnej wewnątrz kolumny na interakcję z fazą ruchomą, zapewniając odpowiednie zwilżenie i kondycjonowanie materiału wypełniającego. Pomaga to w ustaleniu jednolitego rozkładu fazy ruchomej i analitów w kolumnie, optymalizując wydajność separacji i rozdzielczość.

Dodatkowo, wyrównanie pomaga ustabilizować parametry systemu, takie jak ciśnienie, temperatura i natężenie przepływu, minimalizując zmienność podczas kolejnych wstrzyknięć. Pozwalając systemowi osiągnąć stan ustalony, wyrównanie zmniejsza ryzyko dryftu linii bazowej i zapewnia stałą wydajność w czasie.

Problem: Wolny czas wyrównywania kolumny

Możliwa przyczyna	Rozwiązanie
Odczynniki z odwróconą fazą jonową i odczynniki z długołańcuchową parą jonową wymagają dłuższego czasu równoważenia	Używaj odczynników z parą jonową o krótszej długości łańcucha alkilowego

Problem: Różne czasy retencji

Możliwa przyczyna	Rozwiązanie
Stopień - niewystarczający czas regeneracji kolumny	Zwiększyć czas (objętość) wyrównania z początkowym składem fazy ruchomej (A), aby osiągnąć stałą retencję dla wczesnych pików
.Odczynniki z parą jonową - niewystarczający czas wyrównania	Wydłuż czas wyrównania (objętość) Odczynniki z parą jonową mogą wymagać nawet 50 objętości kolumny do zmiany fazy ruchomej
Izokratyczny - niewystarczający czas wyrównania	Przepuścić 10-15 objętości fazy ruchomej przez kolumnę w celu wyrównania

Szczyty

Jeśli wszystkie piki mają taki sam wygląd na chromatogramie, problem powstał przed rozdzieleniem. Jeśli tylko niektóre piki lub tylko jeden pik na chromatogramie eluują ze zniekształconym kształtem, źródło ma charakter chemiczny.

Problem: Broad Peaks

Szerokie piki są generowane albo przez znaczny wpływ ze strony systemu HPLC (złe połączenia kapilarne, puste objętości, zbyt duże komórki detektora lub źle dobrane stałe czasowe), albo przez słabą wydajność kolumny.

Figure 5. Typical chromatograms, A). Normal peaks B) Broad peaks

Problem	Rozwiązanie
Przeciążenie próbki	Rozcieńczyć próbkę 1:10 fazą ruchomą i ponownie wstrzyknąć
Zbyt duża objętość komory detektora	Użyj najmniejszej możliwej objętości komórki zgodnej z potrzebami czułości Użyj detektora bez wymiennika ciepła w systemie
Zbyt duża objętość wtrysku	Zmniejszyć moc rozpuszczalnika do iniekcji, aby skupić substancję rozpuszczoną Zmniejszyć objętość iniekcji Rozcieńczyć próbkę Zasada kciuka: Wstrzyknąć maksymalnie 1% całkowitej objętości probówki kolumny
Duża dodatkowa objętość kolumny	Używaj końcówek i złączy o niskiej lub zerowej objętości martwej Używaj rurek łączących o najmniejszej możliwej średnicy (<0.10 cali i.d.) Podłącz rurki za pomocą dopasowanych złączek
Zbyt wysoka lepkość rozpuszczalnika fazy ruchomej	Zwiększyć temperaturę kolumny Zmienić na rozpuszczalnik o niższej lepkości
Szczytowa dyspersja w zaworze wtryskiwacza	Zmniejsz rozmiar pętli próbki we wstrzykiwaczu Użyj technik wstrzykiwania segmentowego (wprowadź pęcherzyk powietrza z przodu i z tyłu próbki w pętli)
Niska wydajność kolumny	Użyj upakowania o mniejszej średnicy cząstek, fazy ruchomej o niższej lepkości, wyższej temperatury kolumny lub niższej niskiej szybkości
Zbyt długi czas retencji	Użyj elucji gradientowej lub silniejszej izokratycznej fazy ruchomej
Zanieczyszczona głowica kolumny	Frytka lub filtr wlotu wymiennika
Zanieczyszczona lub zużyta kolumna	Zregeneruj kolumnę lub wymień na nową
Częstotliwość próbkowania systemu danych jest zbyt niska	Zwiększ częstotliwość próbkowania .Zwiększyć częstotliwość próbkowania
Wolna stała czasowa detektora	Dostosuj stałą czasową do szerokości piku
Zbyt niska temperatura kolumny	Zwiększyć temperaturę pieca kolumnowego
Niektóre piki są szerokie - np. opóźniona elucja analit zatrzymanych z poprzedniego wstrzyknięcia	Przepłukać kolumnę silnym rozpuszczalnikiem na końcu przebiegu Kończyć gradient przy wyższym stężeniu rozpuszczalnika<
Kolumna ochronna/przedkolumna lub kolumna uszkodzona lub zabrudzona	Zmienić kolumnę ochronną/przedkolumnę lub kolumnę
Próbka rozpuszczona w silnym rozpuszczalniku	Rozpuścić próbkę w fazie ruchomej
Nieprawidłowe pH buforu	Test wpływu pH eluentu na kształt piku
Zbyt niskie stężenie buforu	Użyj stężonego buforu lub dodaj sól, aby zwiększyć całkowitą siłę jonową fazy ruchomej
Efekty dodatkowej kolumny	Sprawdź połączenia kapilarne Używaj krótszych kapilar o mniejszym i.d. Sprawdź objętość martwą
.Nieszczelność między kolumną a detektorem	Napraw nieszczelność Naprawić nieszczelność
Duża komórka detektora	Użyj mniejszej komórki<
Niekompatybilność próbki z systemem lub wytrącanie próbki	Użyj obojętnych powierzchni w częściach systemu (wtryskiwacz, pompa) Użyj prostego eksperymentu z probówką, aby określić rozpuszczalność próbki w fazie ruchomej, aby zapobiec wytrącaniu się na kolumnie

Problem: Ghost Peaks

Piki duchów mogą być spowodowane przez nieznane składniki próbki, późno eluujące piki z poprzednich wstrzyknięć, zanieczyszczenia lub problemy z mieszaniem w związku z fazą ruchomą. Dlatego najlepiej jest zawsze rozpuszczać próbkę w eluencie lub w rozpuszczalniku o słabszej sile elucji. Substancje o absorpcji UV niższej niż eluent mogą generować ujemne piki.

Figure 6. HPLC chromatograms, A) Previous sample, B) After injection of solvent following the solvent with no ghost peak, C) After injection of solvent following the solvent showing a ghost peak

Możliwa przyczyna	Rozwiązanie
Elucja analitów zatrzymanych z poprzedniego wstrzyknięcia	Przepłukać kolumnę silnym rozpuszczalnikiem na końcu przebiegu Zakończyć gradient przy wyższym stężeniu rozpuszczalnika.
Chromatografia par jonowych - zaburzenie równowagi	. Przygotuj próbkę w fazie ruchomej Zmniejsz objętość iniekcji
Oksydacja kwasu trifluorooctowego w mapowaniu peptydów	Przygotowuj codziennie świeże roztwory kwasu trifluorooctowego Używaj przeciwutleniaczy .
Nieznane interferencje w próbce	Użyj oczyszczania próbki lub wstępnej frakcjonacji przed wstrzyknięciem
Zanieczyszczenie kolumny	Przepłukać kolumnę silnym rozpuszczalnikiem po każdym przebiegu Poprawić oczyszczanie próbki
Zanieczyszczenia rozpuszczalnikiem	Używaj rozpuszczalników klasy HPLC
Późno eluujący pik (zwykle szeroki) obecny w próbce	Sprawdź przygotowanie próbki. Włącz gradient (krok), aby szybko eluować składnik

Problem: ujemne wartości szczytowe

Figure 7. A) Normal chromatogram, B) Chromatogram with negative peaks

Prawdopodobna przyczyna	Roztwór
Wykrywanie współczynnika załamania światła - współczynnik załamania substancji rozpuszczonej mniejszy niż współczynnik załamania fazy ruchomej	Odwrócenie polaryzacji w celu uzyskania piku dodatniego
	Detekcja absorbancji UV - absorbancja substancji rozpuszczonej mniejsza niż absorbancja substancji rozpuszczonej mniejsza niż absorbancja fazy ruchomej	Użyj fazy ruchomej o niższej absorbancji UV Jeśli recykling rozpuszczalnika, zatrzymaj recykling, gdy recyklowany rozpuszczalnik wpływa na detekcję<
Rozpuszczalnik próbki i faza ruchoma różnią się znacznie składem (piki wakujące)	Dostosuj lub zmień rozpuszczalnik próbki. W miarę możliwości rozcieńczaj próbkę w fazie ruchomej

Problem: podwojenie wartości szczytowej

Jeśli wszystkie piki mają ramiona lub eluują jako podwójne piki, przyczyną mogą być zatkane filtry liniowe, fryty wlotowe kolumny, zanieczyszczone prekolumny lub pusta objętość na głowicy kolumny. W większości przypadków kolumnę można przywrócić do pierwotnego stanu poprzez wyczyszczenie lub wymianę filtra wlotowego. Krótkoterminowym rozwiązaniem tego problemu może być również odwrócenie kolumny. Zniszczone złoże na wylocie kolumny tylko w niewielkim stopniu przyczynia się do rozprzestrzeniania się piku.

Możliwa przyczyna	Rozwiązanie
Zablokowana frytka	Wymień lub wyczyść frytkę Zainstaluj 0.5 µm między pompą a wtryskiwaczem w celu wyeliminowania zanieczyszczeń fazy ruchomej lub między wtryskiwaczem a kolumną w celu wyeliminowania zanieczyszczeń próbki
Zanieczyszczenie wlotu kolumny ochronnej lub analitycznej	Usuń kolumnę ochronną (jeśli jest obecna) i spróbuj przeprowadzić analizę. W razie potrzeby wymień kolumnę ochronną. Jeśli kolumna analityczna jest zatkana, odwróć ją i przepłucz. Jeśli problem nadal występuje, kolumna może być zatkana silnie zatrzymanymi zanieczyszczeniami. Zastosuj odpowiednią procedurę przywracania. Jeśli problem nadal występuje, fryta wlotowa jest prawdopodobnie (częściowo) zatkana. Wymień kolumnę. Wymień filtr lub wymień kolumnę.
Koelucja związku zakłócającego	Użyj oczyszczania próbki lub wstępnej frakcjonacji Dostosowanie selektywności poprzez zmianę fazy ruchomej lub stacjonarnej
Współwydzielanie związku zakłócającego z poprzedniego wstrzyknięcia	Przepłukanie kolumny silnym rozpuszczalnikiem na końcu przebiegu Gradient końcowy przy wyższym stężeniu rozpuszczalnika
Kolumna przeciążona	Użyj fazy stacjonarnej o większej pojemności Zwiększ średnicę kolumny Zmniejsz ilość próbki
Pustka w kolumnie lub kanałowanie	Wymienić kolumnę
Zbyt silny rozpuszczalnik do iniekcji	Użyj słabszego rozpuszczalnika iniekcyjnego lub silniejszej fazy ruchomej
Zbyt duża objętość próbki	Użyj objętości iniekcji równej 1% objętości próbki.Użyj objętości wstrzyknięcia równej 1% całkowitej objętości probówki kolumny, gdy próbka jest rozcieńczona w fazie ruchomej Zmniejsz objętość próbki Rozcieńcz próbkę Wstrzyknij próbkę przygotowaną w fazie ruchomej
Próbka rozpuszczona w silnym rozpuszczalniku	Rozpuścić próbkę w fazie ruchomej lub (jeśli nie jest to możliwe) wstrzyknąć bardzo małą objętość próbki

Problem: Fronting szczytowy

Figure 8. Typical chromatograms, A) normal without a fronting peak B) with a fronting peak

. Możliwa przyczyna	Rozwiązanie
Kanałowanie w kolumnie	Zmień kolumnę
Kolumna przeciążona	Użyć fazy stacjonarnej o większej pojemności Zwiększyć średnicę kolumny Zmniejszyć ilość próbki Rozcieńczyć próbkę
Uszkodzona lub zabrudzona przedkolumna	Zmień przedkolumnę
Próbka rozpuszczona w niewłaściwym rozpuszczalniku	Rozpuścić próbkę w fazie ruchomej lub (jeśli nie jest to możliwe) wstrzyknąć mniejszą objętość próbki
Interferujące związki w próbce	Kolumna testowa przy użyciu próbki testowej lub kalibracyjnej Zalecane oczyszczenie próbki
Wytrącanie próbki	Użyj prostego eksperymentu z probówką, aby określić rozpuszczalność próbki w fazie ruchomej, aby zapobiec wytrącaniu się na kolumnie

Problem: ogon szczytowy

Ogonienie pików, które są wcześnie eluowane, jest spowodowane efektami dodatkowej kolumny. Aby temu zaradzić, należy sprawdzić cały system - połączenia kapilarne, rurki i komorę detektora. Wtórna, niespecyficzna interakcja z powierzchnią żelu krzemionkowego prowadzi do ogonowania późno eluowanych pików, a nawet do pojawienia się podwójnych pików. Dodanie trietyloaminy lub octanu do fazy ruchomej lub wybranie odpowiedniej fazy stacjonarnej znacznie poprawi postać piku. Niewłaściwie dobrana wartość pH dla fazy ruchomej może również prowadzić do ogonowania pików. Zasadniczo chromatografia powinna być przeprowadzana o jedną jednostkę pH powyżej lub poniżej wartości pK substancji próbki.

Figure 9. Typical chromatograms, A) Normal without a tailing peak B). With a tailing peak

Problem	Rozwiązanie
Podstawowe rozpuszczalniki - oddziaływania silanol	Użyj konkurującej zasady, takiej jak trietyloamina Użyj silniejszej fazy ruchomej Zwiększ stężenie buforu lub soli (chromatografia par jonowych) Użyć kolumny z fazą odwróconą na bazie krzemionki dezaktywowanej zasadą Użyć kolumny polimerowej Użyć niższego pH fazy ruchomej
Rozpuszczalniki chelatujące - metale śladowe w krzemionce zasadowej	Użyj kolumny na bazie krzemionki o wysokiej czystości i niskiej zawartości metali śladowych Dodaj EDTA lub związek chelatujący do fazy ruchomej Użyj kolumny polimerowej
.Kolumna na bazie krzemionki - degradacja przy wysokim pH	Użyj kolumny polimerowej, sterycznie chronionej lub kolumny z fazą odwróconą o wysokim pokryciu Zainstaluj kolumnę saturatora z żelem krzemionkowym pomiędzy pompą a iniektorem
Kolumna na bazie krzemionki - degradacja w wysokiej temperaturze	Obniżenie temperatury do poniżej 50°C
Kolumna na bazie krzemionki - oddziaływania silanolowe	Zmniejsz pH fazy ruchomej, aby stłumić jonizację silanolu Zwiększ stężenie buforu Derywatyzuj substancję rozpuszczoną, aby zmienić oddziaływania polarne
Tworzenie się pustki na czele kolumny	Wymienić kolumnę Aby zapobiec: Szybko obrócić zawór wtryskowy Użyć zaworu wtryskowego z obejściem ciśnienia Uniknąć szoku ciśnieniowego
Przeciążenie kolumny	Zmniejsz rozmiar próbki Zwiększ średnicę kolumny Zastosuj fazę stacjonarną o większej pojemności .Użyj fazy stacjonarnej o większej pojemności
Zablokowany fryt kolumny	Wymień frytynę Dodaj filtr in-line Filtruj próbki
Związki zakłócające w próbce / Zanieczyszczenia	Usprawnij oczyszczanie próbki Sprawdź kolumnę z próbką testową lub próbką kalibracyjną .Używaj rozpuszczalników klasy HPLC
Adsorpcja próbki na kolumnie (szczególnie związków zasadowych)	Użyj innej fazy stacjonarnej (specjalna faza dla związków zasadowych) Użyj buforowanej fazy ruchomej
Próbka reagująca z miejscami aktywnymi	Najpierw sprawdź wydajność kolumny przy użyciu standardowej mieszaniny testowej. Jeśli wyniki dla mieszaniny testowej są dobre, dodaj odczynnik pary jonowej lub konkurencyjny modyfikator zasady lub kwasu
Nieprawidłowe pH fazy ruchomej	Dostosuj pH. Dla związków zasadowych, niższe pH zwykle zapewnia bardziej symetryczne piki
.Niewłaściwy typ kolumny	Wypróbuj inny typ kolumny (np.g., kolumnę dezaktywowaną dla związków zasadowych). Mała (nierówna) pusta przestrzeń na wlocie kolumny. Wymień kolumnę Sprawdź rozdzielone piki
Nieprawidłowy rozpuszczalnik do wstrzykiwania	Piki mogą się rozdzielić, gdy próbka jest wstrzykiwana w silniejszym rozpuszczalniku niż faza ruchoma. Rozpuścić próbkę w fazie ruchomej

Problem: kolce

Możliwa przyczyna	Roztwór
Pęcherzyki powietrza w fazie ruchomej	Zgazować fazę ruchomą Użyć ogranicznika przeciwciśnienia na wylocie detektora Upewnij się, że wszystkie złączki są szczelne
Kolumna przechowywana bez nasadek	Przechowywać kolumnę szczelnie zamkniętą Przepłukać kolumny z odwróconą fazą odgazowanym metanolem

Problem: brak szczytów

Figure 10. Typical chromatograms, A) Normal peaks, B) No peaks, C) Very small peaks

Możliwa przyczyna	Rozwiązanie
Brak przepływu przez czujkę.	Rozwiązanie
Brak przepływu przez detektor; Nieszczelność	Sprawdzić pompę Sprawdzić i dokręcić połączenia i złączki w układzie oraz złączki na końcach kolumn Sprawdzić fryturę Sprawdź skład fazy ruchomej Usuń nieszczelność
Wstrzykiwanie próbki nie jest powtarzalne	Sprawdź system wstrzykiwania próbki
Nie wstrzyknięto próbki	Upewnij się, że wtryskiwacz działa prawidłowo i próbka nie jest wytrącana.
Brak wykrywalności	Upewnij się, że anality są monitorowane w odpowiednich warunkach
Wyłączona lampa detektora lub nieprawidłowe ustawienia	Sprawdź, czy okrążenie jest włączone Sprawdź ustawienia tłumienia lub wzmocnienia. Sprawdź stan lampy. W razie potrzeby wykonaj automatyczne zerowanie
	Brak próbki/uszkodzona próbka/nieprawidłowa próbka	.Upewnij się, że fiolki automatycznego próbnika zawierają wystarczającą ilość próbki bez pęcherzyków powietrza w próbce Oceń wydajność systemu ze świeżym wzorcem, aby potwierdzić, że źródłem problemu jest próbka

Problem: Szczyty z ramionami, podzielone szczyty

Figure 11. Typical chromatograms A) Normal peaks B) Split peaks

Prawdopodobna przyczyna	Rozwiązanie
Uszkodzenie lub zabrudzenie kolumny ochronnej	Wymień kolumnę ochronną
Zabrudzona głowica kolumny	Frytka wlotowa wymiany lub filtr
Martwa przestrzeń głowicy kolumny lub kanały w kolumnie	Użyj nowej kolumny analitycznej
Próbka rozpuszczona w rozpuszczalniku, który nie jest kompatybilny z eluentem	Rozpuścić próbkę w eluencie Zmniejszyć objętość iniekcji

Problem: Zmiana wysokości szczytu (jeden lub więcej szczytów)

Figure 12. Typical chromatograms, A) Normal B) One peak with a different height

Możliwa przyczyna	Rozwiązanie
Jeden lub więcej składników próbki uległo pogorszeniu lub zmieniła się aktywność kolumny	Użyj świeżej próbki lub wzorca, aby potwierdzić, że próbka jest źródłem problemu. Jeśli niektóre lub wszystkie piki są nadal mniejsze niż oczekiwano, wymień kolumnę. Jeśli nowa kolumna poprawi analizę, spróbuj przywrócić starą kolumnę, postępując zgodnie z odpowiednią procedurą. Jeśli wydajność nie ulegnie poprawie, wyrzuć starą kolumnę.
Nieszczelność, szczególnie między portem wtrysku a wlotem kolumny. (Retencja również ulegnie zmianie.)	Sprawdź system pod kątem poluzowanych złączek. Sprawdź pompę pod kątem wycieków, nagromadzenia soli, nietypowych dźwięków. W razie potrzeby wymień uszczelki pompy
Niezgodna objętość próbki	Upewnij się, że próbki są zgodne. W przypadku pętli próbkującej o stałej objętości należy użyć 2-3-krotności objętości pętli, aby upewnić się, że pętla jest całkowicie wypełniona. Upewnij się, że fiolki automatycznego próbnika zawierają wystarczającą ilość próbki i nie zawierają pęcherzyków powietrza. Sprawdź, czy wtryskiwacze strzykawkowe nie zawierają powietrza. W systemach z etapem płukania lub płukania upewnij się, że roztwór płuczący nie wytrąca składników próbki.
Zmieniono ustawienia detektora lub rejestratora	Sprawdź ustawienia
Słaba lampa detektora	Wymień lampę
Zanieczyszczenie w komórce detektora	Wyczyść komórkę

Problem: utrata rozdzielczości

Możliwa przyczyna	Rozwiązanie
Faza ruchoma zanieczyszczona/pogorszona (powodująca zmianę czasów retencji i/lub selektywności)	Przygotuj świeżą fazę ruchomą.
Zablokowana osłona lub kolumna analityczna	Usuń kolumnę ochronną (jeśli jest obecna) i spróbuj przeprowadzić analizę. W razie potrzeby wymień kolumnę ochronną. Jeśli kolumna analityczna jest zatkana, odwróć ją i przepłucz. Jeśli problem nie ustępuje, kolumna może być zatkana silnie zatrzymanymi zanieczyszczeniami. Zastosuj odpowiednią procedurę przywracania. Jeśli problem nadal występuje, wymień kolumnę.

Problem: Zaokrąglone szczyty

Figure 13. Typical chromatograms, A) Normal, B) Rounded Peaks

Możliwe przyczyny	Rozwiązanie
Detektor działający poza liniowym zakresem dynamicznym	Zmniejsz objętość próbki i/lub stężenie. Kolumna przeciążona. Wstrzyknąć mniejszą objętość (np, 10 μL vs. 100 μL) lub rozcieńczenie próbki 1:10 lub 1:100.
Interakcja próbka-kolumna	Zmiana mocy buforu, pH lub składu fazy ruchomej. Podniesienie temperatury kolumny Zmiana typu kolumny. (Analiza struktury substancji rozpuszczonej może pomóc w przewidywaniu interakcji.)

Recovery

Na odzysk próbki z kolumny chromatograficznej wpływa wiele czynników, w tym skład chemiczny kolumny, skład fazy ruchomej, właściwości analitu i parametry operacyjne. Wybór materiału wypełnienia kolumny i składu chemicznego fazy stacjonarnej może znacząco wpłynąć na retencję analitu i zachowanie podczas elucji. Optymalizacja wyboru kolumny w celu dopasowania właściwości fizykochemicznych analitu ma kluczowe znaczenie dla zminimalizowania niespecyficznej sorpcji i maksymalizacji odzysku próbki. Skład fazy ruchomej odgrywa kluczową rolę w elucji analitu i odzyskiwaniu próbki. Dostosowując skład i profil gradientu fazy ruchomej, analitycy mogą zwiększyć wydajność elucji analitu i poprawić jego odzysk.

Problem: Słaby odzysk próbki

Możliwe przyczyny	Rozwiązanie
Absorpcja lub adsorpcja białek	Zmień tryb HPLC, aby zmniejszyć niespecyficzne interakcje. Dodaj do fazy ruchomej środek rozpuszczający białka, silny kwas lub zasadę (tylko w przypadku kolumn polimerowych) lub detergent, taki jak SDS.
Adsorpcja na opakowaniu kolumny	Zwiększ siłę fazy ruchomej, aby zminimalizować adsorpcję. Dla związków zasadowych dodaj konkurencyjną zasadę lub użyj opakowania dezaktywowanego zasadą.
Adsorpcja na rurkach i innych elementach sprzętowych	Używaj obojętnych (PEEK), szklanych lub tytanowych rurek i elementów o niskiej ścieżce.
Oddziaływania chemiczne na wypełnienie kolumny	Upewnij się, że nie występują żadne grupy reaktywne. Użyj wypełnienia polimerowego. Zmień typ i tryb kolumny.
Oddziaływania hydrofobowe między kolumnami stacjonarnymi	Użyj krótkołańcuchowego opakowania z odwróconą fazą. Używaj wypełnień o średnicy porów 300-A. Używaj wypełnień hydrofilowych lub nośników jonowymiennych. Używaj chromatografii oddziaływań hydrofobowych.
Wydajność poniżej 99% dla związków zasadowych nieodwracalna adsorpcja na miejscach aktywnych	Używaj fazy odwróconej typu endcapped, z dezaktywowaną zasadą, sterycznie chronionej, o wysokim pokryciu lub polimerowej.
Wydajność poniżej 90% dla związków kwaśnych - nieodwracalna adsorpcja na miejscach aktywnych./p>	Używaj opakowań typu endcapped lub polimerowych. Kwasić fazę ruchomą.

Leaks

Często po zainstalowaniu nowych części, zwłaszcza jeśli instalacja nie została wykonana prawidłowo, możemy doświadczyć pewnych wycieków. Dodatkowo, nagły wzrost przeciwciśnienia w układzie może również powodować wycieki. Stare, zużyte, zatkane części również mogą być odpowiedzialne za wycieki.

Problem: Wyciek na kolumnie lub złączkach

Możliwa przyczyna	Rozwiązanie
Luźna złączka	Sprawdź połączenia i złączki w systemie i końcówki kolumn i dokręć lub wymień złączkę<<
Odpady (biały proszek) na luźnej złączce	Odetnij rurkę i wymień króciec Rozbierz złączkę, przepłucz i złóż ponownie

Problem: Wyciek z detektora

. Możliwe przyczyny	Rozwiązanie
Awaria uszczelnienia czujki	Wymień uszczelkę czujki lub uszczelki

Problem: Nieszczelność zaworu wtryskowego

. Możliwa przyczyna	Rozwiązanie
Zużyty lub porysowany wirnik zaworu	Wymień wirnik zaworu

Problem: wyciek z pompy

Możliwa przyczyna	Rozwiązanie
Awaria uszczelnienia pompy
Awaria uszczelnienia pompy	Wymień uszczelnienie pompy. Sprawdzić tłok pod kątem zarysowań i w razie potrzeby wymienić.

Selektywność

Nagłe zmiany selektywności chromatograficznej mogą wynikać z różnych czynników, w tym kondycjonowania kolumny, składu fazy ruchomej, wpływu matrycy próbki, wahań temperatury i natężenia przepływu oraz degradacji kolumny. Rozumiejąc te czynniki i wdrażając odpowiednie środki w celu złagodzenia ich skutków, analitycy mogą utrzymać wiarygodność i powtarzalność wyników chromatograficznych, zapewniając dokładną i spójną wydajność analityczną.

Problem: Różnice w selektywności

Figure 14. Typical chromatograms, A) Normal, B) Problem of change in selectivity

Możliwa przyczyna	Roztwór
Różnice w składzie fazy ruchomej	Sprawdzić pompę Sprawdzić fryturę Unikaj parowania lub degradacji fazy ruchomej
Nowy skład eluentu jest nieco inny (tj.e. pH nie jest dostosowane, rozpuszczalnik zawiera zanieczyszczenia)	Przygotuj nowy eluent Dokładnie określ objętość, dodatek soli i wartość pH
Zbyt słaby rozpuszczalnik/niebuforowany eluent	Użyj buforu lub systemu pary jonowej
Próbka rozpuszczona w różnych rozpuszczalnikach	Rozpuścić próbkę w fazie ruchomej lub (jeśli nie jest to możliwe) wstrzyknąć bardzo małą objętość próbki
Zmniejszenie żywotności kolumny; zanieczyszczenie	Wymień kolumnę Usprawnij oczyszczanie próbki Sprawdź kolumnę z mieszaniną testową Używaj rozpuszczalników klasy HPLC
. Wahania temperatury w buforze	Używaj termostatu kolumny
.Powtarzalność między kolumnami	Wymień kolumnę Sprawdź u producenta
Kolumna nieodwracalnie zmieniona	Użyj nowej kolumny

Baseline

Chromatograficzna linia bazowa służy jako punkt odniesienia do wykrywania analitów w analizie chromatograficznej. Reprezentuje sygnał wytwarzany przez detektor przy braku jakiejkolwiek elucji analitu, wskazując podstawowy poziom szumów i stabilność systemu. Stabilna i dobrze zdefiniowana linia bazowa jest niezbędna do dokładnego wykrywania pików, integracji i kwantyfikacji w analizie chromatograficznej. Wahania lub zakłócenia linii bazowej, takie jak dryf, szum lub skoki, mogą zaciemniać piki analitu i prowadzić do niedokładnych wyników. Czynniki przyczyniające się do zakłóceń linii bazowej obejmują wahania składu fazy ruchomej, temperatury, ciśnienia i czułości detektora, a także kwestie związane z urządzeniem, takie jak szum detektora i zakłócenia elektroniczne. Właściwe techniki korekcji linii bazowej, takie jak odejmowanie linii bazowej lub filtrowanie, są często stosowane w celu zwiększenia stosunku sygnału do szumu i poprawy jakości danych. Ponadto regularna konserwacja systemu, w tym płukanie kolumn, czyszczenie detektora i kalibracja przyrządu, jest niezbędna do utrzymania stabilności linii bazowej i zapewnienia wiarygodności wyników chromatograficznych. Podsumowując, chromatograficzna linia bazowa odgrywa kluczową rolę w analizie chromatograficznej, służąc jako podstawa do dokładnego i precyzyjnego określania stężeń analitów. Utrzymanie stabilności linii bazowej jest niezbędne do uzyskania wiarygodnych i powtarzalnych wyników chromatograficznych w zastosowaniach analitycznych.

Problem: Zakłócenie w czasie pustki

Prawdopodobna przyczyna	Rozwiązanie
Pęcherzyki powietrza w fazie ruchomej	Odgazuj lub użyj ogranicznika przeciwciśnienia na detektorze
Dodatni-ujemny - różnica współczynnika załamania rozpuszczalnika iniekcyjnego i fazy ruchomej	Normalne dla wielu próbek Użyj fazy ruchomej jako rozpuszczalnika próbki

Problem: dryfująca linia bazowa

Figure 15. Typical chromatograms, A) Normal B) Baseline Drift

Możliwa przyczyna	Roztwór
Kierunek ujemny (elucja gradientowa) - absorbancja fazy ruchomej A	Użyj rozpuszczalników fazy ruchomej nie absorbujących promieniowania UV Użyj rozpuszczalników fazy ruchomej klasy HPLC
Kierunek dodatni (elucja gradientowa) - absorbancja fazy ruchomej B	Używaj wyższej długości fali detektora absorbancji UV Używaj nie absorbujących UV rozpuszczalników fazy ruchomej Używaj rozpuszczalników fazy ruchomej klasy HPLC Sprawdź kontrolę temperatury kolumny
Kierunek pozytywny - gromadzenie się zanieczyszczeń i elucja	Przepłukać kolumnę silnym rozpuszczalnikiem Oczyścić próbkę .Stosować rozpuszczalniki klasy HPLC
Faliste lub pofalowane - zmiany temperatury w pomieszczeniu	Monitoruj i kontroluj zmiany temperatury w pomieszczeniu Zaizoluj kolumnę lub użyj pieca kolumnowego Przykryj detektor współczynnika załamania światła i trzymaj go z dala od prądów powietrza.

Problem: Hałas

Figure 16. Typical chromatograms, A) Normal, B) Baseline noise (regular)

Figure 17. Typical chromatograms, A) Normal B) Problem (Irregular baseline noise)

Możliwa przyczyna	Rozwiązanie
Ciągły - problem z lampą detektora lub zabrudzona niska cela	Wymień lampę UV (zgodnie z instrukcjami producenta) Wymień lampę UV na nową.Wyczyść i przepłucz niską komorę
Stopniowe lub izokratyczne dozowanie - brak mieszania rozpuszczalników	Użyj odpowiedniego urządzenia mieszającego Sprawdź precyzję dozowania, dodając do jednego rozpuszczalnika związek absorbujący promieniowanie UV i monitoruj wyjście detektora absorbancji UV
Dozowanie gradientowe lub izokratyczne - nieprawidłowo działające zawory dozujące	Wyczyść lub wymień precyzyjne zawory dozujące Częściowo wymieszać rozpuszczalniki
Okresowe ostre skoki - zewnętrzne zakłócenia elektryczne	Użyj stabilizatora napięcia dla systemu LC Użyj niezależnego obwodu elektrycznego
Okresowe - impulsy pompy	Serwis lub wymiana tłumika pulsacji Usuń powietrze z pompy Wymień uszczelki tłoka Oczyść lub wymień zawory zwrotne.
Przypadkowe - nagromadzenie zanieczyszczeń	Przepłukać kolumnę silnym rozpuszczalnikiem Oczyścić próbkę Użyć rozpuszczalnika klasy HPLC
Spikes - pęcherzyk powietrza w detektorze	Zgazować fazę ruchomą Użyć ogranicznika przeciwciśnienia na wylocie detektora
Skoki - temperatura kolumny wyższa niż temperatura wrzenia rozpuszczalnika	Użyj niższej temperatury kolumny

Ciśnienie

Problem z ciśnieniem jest zwykle związany ze zbyt wysokim ciśnieniem wstecznym, a aby wyjaśnić, skąd bierze się problem, dobrą praktyką laboratoryjną jest stopniowe odłączanie systemu, zaczynając od detektora i pracując sekwencyjnie z powrotem do wtryskiwacza, a następnie do pompy.

Problem: Spadek ciśnienia

Prawdopodobna przyczyna	Rozwiązanie
Niewystarczająco niski poziom do pompowania	Odkręć korek na zbiorniku fazy ruchomej
Nieszczelność przewodów hydraulicznych od pompy do kolumny	Dokręć lub wymień złączki .Dokręcić wirnik w zaworze wtryskowym
Nieszczelny zawór zwrotny pompy lub uszczelki	Wymień lub wyczyść zawory zwrotne Wymień uszczelki pompy
Powietrze uwięzione w głowicy pompy. (Ujawnione przez wahania ciśnienia.)	Odłącz rurkę na kolumnie ochronnej (jeśli jest) lub wlocie kolumny analitycznej. Sprawdź przepływ. Przepłukać pompę przy wysokim natężeniu przepływu (np. 10 ml/min.), w razie potrzeby zalać system. (Jeśli system ma zawór zwrotny, poluzuj zawór, aby umożliwić ujście powietrza.
Kawitacje pompy	Odgazuj rozpuszczalnik Sprawdzić, czy nie ma niedrożności w linii od zbiornika rozpuszczalnika do pompy Wymienić frytkę w linii wlotowej

Problem: wahania ciśnienia

Możliwa przyczyna	Roztwór
Pęcherzyk powietrza w pompie	Zgazuj rozpuszczalnik .Odpowietrzyć rozpuszczalnik helem Przepłukać układ izopropanolem
Nieszczelny zawór zwrotny pompy lub uszczelki	Wymień lub wyczyść zawory zwrotne Wymień uszczelki pompy

Problem: Wysokie ciśnienie wsteczne

Możliwa przyczyna	Rozwiązanie
Kolumna wstępna/ochrony zablokowana	Wymień kolumnę wstępną/ochrony Frytka wlotowa kolumny wymiany Kolumna płukania wstecznego Kolumna wymiany
Zablokowana głowica kolumny	Zmień filtr głowicy kolumny Przepłucz kolumnę Zmień kolumnę
Kapilara zablokowana	Wymień kapilarę
Kolumna zablokowana nieodwracalnie zaadsorbowaną próbką	Usprawnić oczyszczanie próbki Użyć kolumny ochronnej Przepłukać kolumnę silnym rozpuszczalnikiem w celu rozpuszczenia blokady
Zbyt mały rozmiar cząstek w kolumnie (na przykład 3 mikrometry)	Użyj cząstek o większym rozmiarze (na przykład 5 mikrometrów)
Rozwój drobnoustrojów na kolumnie	Używaj co najmniej 10% modyfikatora organicznego w fazie ruchomej Używaj codziennie świeżego buforu Dodaj 0.02% azydku sodu do wodnej fazy ruchomej Przechowuj kolumnę w co najmniej 25% rozpuszczalniku organicznym bez buforu
Zbyt wysoka lepkość fazy ruchomej	Użyj rozpuszczalników o niższej lepkości lub wyższej temperatury
Plugged frit in-line filter or guard column	Wymienić frytkę lub kolumnę ochronną
Podłączona frytka wlotowa	Wymienić łącznik końcowy lub zespół fryty
Kolumny polimerowe - zmiana rozpuszczalnika zmiana rozpuszczalnika powoduje pęcznienie wypełnienia	Używaj właściwego rozpuszczalnika z kolumną Zmień na właściwy skład rozpuszczalnika Zapoznaj się z tabelą kompatybilności rozpuszczalników producenta Użyj kolumny z wyższym procentem usieciowania
Wytrącanie się soli (szczególnie w chromatografii w odwróconym układzie faz z wysokim stężeniem rozpuszczalnika organicznego w fazie ruchomej)	Zapewnij zgodność fazy ruchomej ze stężeniem buforu Zmniejsz siłę jonową i stosunek wody do rozpuszczalnika organicznego Zmieszaj fazę ruchomą
.Gdy wtryskiwacz odłączony od kolumny - zatkanie wtryskiwacza	Wyczyść wtryskiwacz, jeśli się nie powiedzie wymień

Flow

Problem: Brak przepływu

Figure 18. Typical chromatograms A) Normal, B) Problem (No flow)

Możliwa przyczyna	Rozwiązanie
Pompa wyłączona	Uruchom pompę
.Przepływ przerwany/zakłócony	Sprawdź poziom fazy ruchomej w zbiorniku(ach). Sprawdzić przepływ w całym systemie. Sprawdzić pętlę próbki pod kątem niedrożności lub blokady powietrznej. Upewnij się, że składniki fazy ruchomej są mieszalne, a faza ruchoma jest prawidłowo odgazowana.
Nieszczelność	Sprawdzić system pod kątem luźnych złączy. Sprawdź pompę pod kątem wycieków, nagromadzenia soli, nietypowych dźwięków. W razie potrzeby wymień uszczelki pompy
	Powietrze uwięzione w głowicy pompy (ujawnione przez wahania ciśnienia)	Odłącz rurkę przy kolumnie ochronnej (jeśli jest) lub wlocie kolumny analitycznej. Sprawdź przepływ. Przepłukać pompę przy wysokim natężeniu przepływu (np. 5-10 ml/min.), w razie potrzeby zalać system. (Jeśli system posiada zawór zwrotny, poluzuj zawór, aby umożliwić ujście powietrza. Jeśli problem nadal występuje, przepłukać układ 100% metanolem lub izopropanolem. Jeśli problem nadal występuje, skontaktuj się z producentem systemu.

Dalsze zalecenia

Sugerujemy również zapoznanie się z sekcjami dotyczącymi konserwacji i rozwiązywania problemów w instrukcji obsługi urządzenia lub skontaktowanie się z inżynierem serwisu. Nowoczesne systemy HPLC często posiadają funkcje autodiagnostyki, które pomagają wyizolować problematyczny obszar w urządzeniu. W przypadku utrzymujących się problemów związanych z kolumną lub analizą należy skontaktować się z działem obsługi technicznej Supelco.

Pozostałe strony tego przewodnika zawierają procedury przywracania wydajności kolumny po utracie rozdzielczości, retencji lub selektywności, sugestie dotyczące zapobiegania i rozwiązywania problemów sprzętowych z kolumnami oraz wybór produktów do ochrony kolumn z oferty Supelco. Na naszej stronie internetowej można znaleźć kompletną linię akcesoriów, które przedłużają żywotność kolumn i ogólnie upraszczają lub usprawniają analizę (U)HPLC lub FPLC^® 

>

PRZYWRACANIE WYDAJNOŚCI KOLUMNY

Wystawienie kolumny na działanie próbek lub rozpuszczalników zawierających wysoce adsorpcyjne składniki spowoduje wzrost przeciwciśnienia i zmianę selektywności. Często kolumnę można przywrócić do pierwotnej wydajności, stosując odpowiednie protokoły płukania. Podczas regeneracji po płukaniu rozpuszczalnikiem, kolumna powinna zostać odwrócona i przeniesiona z analitycznego systemu HPLC do prostej, niedrogiej pompy. Alternatywnie, należy odłączyć kolumnę od detektora i płukać bezpośrednio do odpadów. Każdy rozpuszczalnik należy przepłukać co najmniej 20, a najlepiej 30 objętościami kolumny.

Najważniejsze jest uważne przeczytanie instrukcji dołączonej do każdej kolumny. Arkusz ten zawiera również informacje na temat sugerowanych procedur pielęgnacji i regeneracji kolumn. Zalecenia te muszą być przestrzegane. Zanieczyszczenie kolumny w górnej części cząstkami stałymi powinno być łatwo usunięte poprzez płukanie kolumny przez około 5 do 20 objętości kolumny w trybie płukania wstecznego, ale tylko wtedy, gdy producent kolumny na to pozwala - ważne jest, aby upewnić się, że obie fryty kolumny (wlotowa i wylotowa) mają taką samą porowatość. Należy pamiętać, że małe cząstki uwięzione głębiej w wypełnieniu kolumny prawdopodobnie nie zostaną usunięte. W wyniku takiego płukania przeciwciśnienie w kolumnie powinno być nieco niższe. Usunięcie niespecyficznie związanego materiału z kolumny jest trudne, a wynik jest zwykle nieprzewidywalny, ponieważ zwykle nie wiemy, jakie związki są zanieczyszczeniami. Współczynnik sukcesu może wynosić od 0 do 100%. Aby w pełni przywrócić upakowanie kolumny, jednorodność dla kolumn wypełnionych cząstkami mniejszymi niż 5 µm jest bardzo mało prawdopodobna. Zwykle płukanie wsteczne kolumny pomaga tylko przez krótki czas.

Jeśli zdecydujesz się na płukanie/regenerację kolumny, poniższe procedury krok po kroku powinny teoretycznie odmłodzić kolumnę, której wydajność pogorszyła się z powodu zanieczyszczenia próbki.

Uwaga! Wszystkie rozpuszczalniki używane do regeneracji kolumny muszą być na tym samym poziomie jakości analitycznej, co zwykle używane z tą kolumną podczas codziennej analizy.

1. Odłącz i odwróć kolumnę.
2. Podłącz ją do pompy, ale nie do detektora.
3. Postępuj zgodnie z odpowiednią procedurą płukania podaną w poniższej tabeli, używając natężenia przepływu, które powoduje ciśnienie wsteczne kolumny 1500-4500 psi, ale nigdy nie wyższe niż maksymalne zalecane ciśnienie w instrukcji obsługi producenta. Jeśli posiadasz kolumnę Supelco^®, przeprowadź analizę przy użyciu mieszaniny testowej i warunków wymienionych w arkuszu danych.
4. Kondycjonuj kolumnę przy użyciu zwykłego rozpuszczalnika
5. Przeprowadź test kolumny przy użyciu próbki mieszaniny testowej. Wydajność, symetria i pojemność powinny mieścić się w zakresie 10-15% wartości podanych w arkuszu testowym. Jeśli tak nie jest, wymień kolumnę.

Uwaga: Objętości wymienione w tabeli dotyczą kolumn 25 cm x 4,6 mm I.D., które mają objętość kolumny 4,15 ml. Podczas przywracania kolumny o średnicy wewnętrznej 4,6 mm krótszej lub dłuższej niż 25 cm, należy pomnożyć wszystkie objętości przez stosunek długości kolumny do 25 (np. dla kolumny 15 cm: 15/25 lub 0,6 razy objętość). W przypadku przywracania kolumny o średnicy wewnętrznej innej niż 4,6 mm należy pomnożyć wszystkie objętości przez stosunek kwadratu średnicy wewnętrznej kolumny do (4,6)²  (np. dla kolumny o średnicy wewnętrznej 3,2 mm: (3,2)²/(4,6)² = 10,24/21,16 = 0,48 razy wartości w tabeli).

Procedury przywracania kolumny

. Column Type	Column rejuvenation procedure<
Kolumna krzemionkowa	Przepłukać następująco: 50 mL heksanu 50 mL chlorku metylenu 50 mL 2-propanolu 50 mL metanolu 25 mL chlorku metylenu 25 mL fazy ruchomej Oceń wydajność kolumny zgodnie z warunkami określonymi przez producenta. Uwaga: Patrz także Roztwór do regeneracji kolumny krzemionkowej w celu odmłodzenia dezaktywowanej kolumny krzemionkowej.
SUPELCOSIL LC-PCN Column	A. Aby usunąć białko Przepłukać kolumnę 10 objętościami acetonitrylu:wody, 50:50, zawierającymi 0,1% kwasu trifluorooctowego. B. Aby usunąć TCA Przepłukać kolumnę 10 objętościami wody destylowanej (dostosować pH do 2.5 za pomocą H3PO4), a następnie po 10 objętości kolumny: wody (w celu usunięcia soli) metanolu (w celu usunięcia wody) metanolu/chlorku metylenu, 50:50 (ogólny roztwór czyszczący) metanol Jeśli wydajność kolumny nadal nie jest akceptowalna, przygotuj bufor fazy ruchomej w 10-krotnym stężeniu używanym do analizy i przeprowadź przez kolumnę przez noc.* *Uwaga: w przypadku niektórych typów buforów i/lub stężeń 10-krotny wzrost stężenia może spowodować wytrącenie.
Kolumna odwróconej fazy na bazie krzemionki (alkilowa (C8, C18 itd.), fenylowa lub krzemionkowa.), kolumna fenylowa lub difenylowa, kolumna SUPELCOSIL LC-PAH)	A. Próbki rozpuszczalne w wodzie Przepłukać następującymi substancjami: Przepłukać ciepłą (60 °C) wodą destylowaną 50 mL metanolu 50 mL acetonitrylu 25 mL metanolu 25 mL fazy ruchomej Oceń wydajność kolumny. B. Próbki nierozpuszczalne w wodzie Przepłukać następującymi substancjami: 50 mL 2-propanolu 50 mL chlorku metylenu 50 mL heksanu 25 mL izopropanolu 25 mL fazy ruchomej Oceń wydajność kolumny.
Kolumny jonowymienne na bazie krzemionki (silna lub słaba wymiana anionów lub kationów)	Większość analiz z wykorzystaniem systemów wymiany jonowej wykorzystuje jonowe fazy ruchome. Związki, które mogą wpływać na wydajność kolumny są zazwyczaj nierozpuszczalne lub tylko słabo rozpuszczalne w wodzie. Poniższa procedura powinna być wystarczająca do usunięcia tych związków. Przepłukać następującymi substancjami: 50 mL gorącej (40-60 °C) wody destylowanej 50 mL metanolu 50 mL acetonitrylu 25 mL chlorku metylenu 25 mL metanolu 25 mL fazy ruchomej Oceń wydajność kolumny.
Kolumna z fazą polarną (kolumna aminowa, cyjanowa lub diolowa lub kolumna chiralna typu Pirkle).	Dla kolumny używanej w trybie fazy odwróconej (np, rozpuszczalnik organiczny/faza ruchoma buforu wodnego), należy postępować zgodnie z tą samą procedurą czyszczenia, co w przypadku kolumn z fazą odwróconą na bazie krzemionki. W przypadku kolumny używanej z niewodnymi fazami ruchomymi należy zastosować następujący schemat: Przepłukać następującymi substancjami: 50 mL chloroformu 50 mL metanolu 50 mL acetonitrylu 25 ml chlorku metylenu 25 ml metanolu 25 ml fazy ruchomej Oceń wydajność kolumny.
Kolumny na bazie krzemionki do RPLC białek i peptydów	Postępuj zgodnie z protokołem dla kolumn z fazą odwróconą na bazie krzemionki. Alternatywnie, wykonaj jedno lub więcej wstrzyknięć 100 μL trifluoroetanolu (określ liczbę wstrzyknięć, oceniając wydajność kolumny po każdym wstrzyknięciu). Oceń wydajność kolumny.

Właściwości typowych rozpuszczalników organicznych powszechnie stosowanych w HPLC

Rozpuszczalnik	Polaryzacja	Mieszalny z wodą?	UV Cutoff-	Refractive Index at 20 °C	Wytrzymałość rozpuszczalnika, ∈o (krzemionka)	Liscosity at 20 °C, cP
heksan	niepolarny	no	200	1.375	0	0.33
Isooktan	↓	nie	200	1.391	0.01	0.5
Czterochlorek węgla	↓	nie	263	1.4595	0.14	0.97
Chloroform	↓	nie	245	1.446	0.31	0.57
Chlorek metylenu	↓	nie	235	1.424	0.32	0.44
Tetrahydrofuran	↓	tak	215	1.407	0.35	0.55
Eter dietylowy	↓	nie	215	1.353	0.29	0.23
Aceton	↓	tak	330	1.359	0.43	0.32
Octan etylu	↓	słabo	260	1.372	0.45	0.45
Dioksan	↓	tak	215	1.422	0.49	1.54
Acetonitryl	↓	tak	190	1.344	0.5	0.37
2-Propanol	↓	tak	210	1.377	0.63	2.3
Metanol	↓	tak	205	1.329	0.73	0.6
Woda	polar	tak	--	1.3328	>0.73	1

Niezwiązane kolumny krzemionkowe narażone na działanie rozpuszczalnika polarnego

Próbki i fazy ruchome zawierające bardzo silnie polarne rozpuszczalniki, takie jak woda lub alkohole, mogą dezaktywować niepowlekane kolumny krzemionkowe HPLC. Działanie to może drastycznie wpłynąć na wydajność kolumny, w szczególności na retencję substancji rozpuszczonej i selektywność. Nawet długotrwałe płukanie kolumny rozpuszczalnikiem niepolarnym tylko częściowo przywraca wydajność kolumny, jednocześnie marnując chemikalia. Roztwór do regeneracji krzemionki (zawierający kwas octowy, dimetoksypropan i chlorek metylenu) może szybko i niedrogo przywrócić wydajność kolumny krzemionkowej poprzez usunięcie uwięzionego materiału polarnego. Pompuj roztwór przez uszkodzoną kolumnę przez 10 minut z prędkością 4 ml/minutę, a następnie przepłukuj fazą ruchomą przez 10 minut z prędkością 2 ml/minutę. Ocenić wydajność kolumny przy użyciu mieszaniny testowej do oceny kolumn krzemionkowych. Wydajność powinna być praktycznie taka sama jak przed wprowadzeniem rozpuszczalnika polarnego.

PRZECHOWYWANIE KOLUMNY

Przechowywanie w kolumnie może być krótko-, średnio- i długoterminowe.

• Krótkoterminowe przechowywanie, tj. przez noc, faza ruchoma użyta w ostatniej analizie może pozostać w kolumnie. Alternatywnie, możliwe jest również przejście fazy ruchomej przy bardzo niskim natężeniu przepływu (zwłaszcza jeśli stężenie buforu w fazie ruchomej jest wysokie, 50 mM). W takim przypadku kondycjonowanie kolumny można potencjalnie pominąć przed kontynuowaniem analizy następnego dnia. Opcja ta jest szczególnie zalecana w przypadku separacji w fazie normalnej, gdzie zmiana składu fazy ruchomej może skutkować długotrwałą ponowną kalibracją. Jeśli jednak stężenie buforu w fazie ruchomej jest bardzo wysokie (0,5 M), wówczas żywotność części pompy (np. wtryskiwacza i zaworów przełączających) może zależeć od czasu kontaktu z buforem o wysokim stężeniu. To samo dotyczy kolumny, jeśli pH jest zbliżone do limitu kolumny (dla większości kolumn opartych na krzemionce pH 2 do pH 7). Niektóre sole, w szczególności sole chlorkowe, są bardzo korozyjne dla stali nierdzewnej i mogą atakować ścianki kolumny, a także wlot i wylot fryty. W takich przypadkach kolumnę (i cały system) należy przepłukać mniej agresywną fazą ruchomą. W takim przypadku zalecałbym przepłukanie kolumny fazą ruchomą bogatą w wodę (~90%) przy około 10 objętościach kolumny (przybliżone objętości kolumn dla niektórych popularnych rozmiarów kolumn można znaleźć w poniższej tabeli).
  

Przybliżone objętości kolumn dla niektórych popularnych wymiarów kolumn i ich wielokrotności

Długość kolumny (mm)	Identyfikator kolumny (mm)	Przybliż.Objętość kolumny (ml)	10x Objętość kolumny (ml)	15x Objętość kolumny (ml)
250	4.6	4.15	41.5	62.3
250	2.0	0.79	7.9	11.8
150	4.6	2.49	24.9	37.4
150	2.0	0.47	4.7	7.1
100	4.6	1.66	16.6	24.9
100	2.0	0.31	3.1	4.7
50	4.6	0.83	8.3	12.5
50	2.0	0.16	1.6	2.4
25	4.6	0.42	4.2	6.2
25	2.0	0.08	0.8	1.2
Uwaga: Objętość wskazana w tabeli musi faktycznie przejść przez kolumnę, jeśli po prostu wymieniasz butelkę z rozpuszczalnikiem i wyjmujesz rurkę z jednego rozpuszczalnika i umieszczasz ją w innym, należy wziąć pod uwagę objętość rurki (~ 2-3 ml), odgazowywacza (starsze odgazowywacze mogą mieć do 15 ml, nowsze ~ 4 ml), pompy (~ 1 ml), wtryskiwacza i w zależności od szybkości przepływu dodać dodatkowy czas na dotarcie rozpuszczalnika do kolumny.

Jeśli odłączasz kolumnę od urządzenia, zatyczki końcowe powinny być szczelnie zamocowane, aby zapobiec parowaniu rozpuszczalnika prowadzącemu do wysuszenia fazy stacjonarnej. Najgorszym scenariuszem jest nieprawidłowo umyta kolumna, która była wcześniej używana z solą o wysokim stężeniu i z czasem wyschła - powstaną kryształy soli, a kolumna najprawdopodobniej zostanie nieodwracalnie uszkodzona. Jednak niektóre kolumny mogą być przechowywane w stanie suchym, a inne nie - należy sprawdzić wytyczne producenta dotyczące pielęgnacji kolumn. Standardowe kolumny HPLC powinny być przechowywane w temperaturze pokojowej i nigdy w lodówce lub zamrażarce (wyjątek stanowią kolumny powinowactwa modyfikowane białkami lub aktywne reaktory enzymatyczne). Zalecenia zawarte w tym paragrafie dotyczą również średnio- i długoterminowego przechowywania kolumn.

• Przechowywanie w średnich odstępach czasu, tj. 2 dni lub w weekend, kolumny należy przepłukać. Intensywność lub objętość płukania zależy od stężenia buforu używanego podczas analizy. Ogólnie zaleca się, aby najpierw wypłukać środki buforujące z kolumny za pomocą około 10 objętości fazy ruchomej z 10% rozpuszczalnikiem organicznym w wodzie. W tym przypadku płukanie będzie skuteczne, a także unikniemy wytrącania się buforu i możliwych problemów z odwadnianiem kolumny. Następnie kolumna może pozostać podłączona do urządzenia lub odłączona i zamknięta zaślepkami. Przechowywanie kolumny HILIC w mieszaninie acetonitrylu i wody może wymagać długiego czasu na ponowną kalibrację, jeśli w metodzie analitycznej używany jest bufor o niskiej sile jonowej (na przykład 5 mM octan amonu). Dlatego w przypadku kolumn HILIC zaleca się przechowywanie ich w rozpuszczalnikach zawierających 80-90% acetonitrylu i buforach zawierających 5-10 mM octanu amonu lub mrówczanu amonu.
  Fazy jonowymienne i mieszane zawierające grupy funkcyjne kwasu karboksylowego (na przykład słabe fazy kationowymienne) nie mogą być przechowywane w roztworach zawierających alkohole, ze względu na powolną estryfikację i wynikającą z niej zmianę selektywności/pojemności.

• Dla długotrwałego przechowywania, kolumny oparte na krzemionce, po odpowiednim przemyciu min. 15 objętościami kolumny przy użyciu ~ 10% rozpuszczalnika organicznego w wodzie, powinny być przepłukiwane fazą ruchomą bogatą w organiczne substancje przez min. 10 objętości kolumny i mogą być przechowywane w rozpuszczalniku aprotycznym. Jeśli woda może być również obecna, nie powinna być w wyższych stężeniach, zdecydowanie mniej niż 50%. Najlepszym rozpuszczalnikiem do przechowywania zalecanym w literaturze jest acetonitryl lub metanol (istnieją pewne wyjątki, na przykład kolumny z modyfikacją amidową, które powinny być przechowywane wyłącznie w acetonitrylu). Niektóre badania1 wskazują również, że w warunkach RP szybkość erozji i korozji elementów HPLC ze stali nierdzewnej przy użyciu czystego acetonitrylu lub metanolu była wyższa niż w przypadku zmieszania ich z wodą. Dlatego 90% acetonitryl lub metanol jest doskonałym środkiem do długoterminowego przechowywania większości kolumn z fazą odwróconą. W przypadku kolumn z odwróconą fazą, roztwór do przechowywania stanowi mieszanina izopropanolu i wody (80/20), ze względu na wyższą lepkość izopropanolu; ciśnienie pary i mniejsze ryzyko wyschnięcia kolumny, nawet jeśli złącza końcowe nie są całkowicie uszczelnione. Izopropanol jest również silniejszym eluentem, dlatego po przechowywaniu w izopropanolu możemy być pewni, że jeszcze więcej zanieczyszczeń zostanie wypłukanych niż w przypadku gradientów acetonitrylu lub metanolu. Wreszcie, izopropanol jest również mniej toksyczny. Ważne jest, aby pamiętać, że wszystkie fazy ruchome używane do płukania, mycia lub przechowywania kolumn muszą być tej samej jakości co te używane do analizy. Kolumny powinny być przechowywane w temperaturze pokojowej (wyjątkiem mogą być np. kolumny powinowactwa, jak wspomniano wcześniej) w oryginalnym pudełku, z kopią certyfikatu analizy (CoA) / raportu kolumny, być może także z dziennikiem kolumny, aby zobaczyć poprzednie zastosowania, aby ocenić kolumnę przed przyszłym użyciem.

Jak długo kolumny powinny być przechowywane? To zależy od wielu aspektów. Niektóre kolumny nie zmieniają się nawet po 5 lub 10 latach przechowywania. Jeśli zdecydujesz się wypróbować kolumnę po tak długim okresie przechowywania, załóż, że kolumna najprawdopodobniej wyschła i należy ją ponownie zwilżyć, najpierw przepłukując 100% acetonitrylem (fazy RP), a następnie wyrównując w fazie ruchomej przez około 1 godzinę przed wykonaniem jakichkolwiek pomiarów selektywności. Dodatkowo można przeprowadzić test mieszanki kolumnowej i porównać dane z CoA.

Prawidłowe przechowywanie kolumny ma zasadnicze znaczenie dla prawidłowej chromatografii i dłuższej żywotności kolumny.

Mieszanki testowe kolumn

Mieszanki do oceny wydajności kolumn HPLC.

Dobrze zdefiniowane mieszaniny testowe umożliwiają rozwiązywanie problemów chromatograficznych, optymalizację wydajności systemu i ocenę kolumn w warunkach, w których ich wydajność jest zrozumiała. Nasze mieszaniny testowe wysyłamy w bursztynowych ampułkach, aby zapobiec fotodegradacji, a także dołączamy instrukcje dotyczące prawidłowego użytkowania i interpretacji wyników.

ZAPOBIEGANIE I ROZWIĄZYWANIE TYPOWYCH PROBLEMÓW SPRZĘTOWYCH

Zapobieganie nieszczelnościom

Nieszczelności są częstym problemem w analizach HPLC. Aby zminimalizować nieszczelności w systemie, należy unikać wymiany sprzętu i złączek pochodzących od różnych producentów. Niekompatybilne złączki można początkowo zmusić do dopasowania, ale separacja może wykazywać problemy, a powtarzające się połączenia mogą ostatecznie spowodować wyciek złączki. Jeśli wymiana jest konieczna, należy użyć odpowiednich adapterów i sprawdzić szczelność wszystkich połączeń przed przystąpieniem do dalszych czynności.

Sole o wysokim stężeniu (>0,2 M) i żrące fazy ruchome mogą zmniejszyć wydajność uszczelnienia pompy. Żywotność uszczelek wirnika wtryskiwacza zależy również od warunków fazy ruchomej, w szczególności pracy przy wysokim pH. W niektórych przypadkach długotrwałe stosowanie odczynników z parą jonową ma wpływ na smarowanie tłoków pompy, co może powodować niewielkie nieszczelności uszczelnienia. Niektóre uszczelki nie działają dobrze z pewnymi rozpuszczalnikami. Przed użyciem pompy w niekorzystnych warunkach należy zapoznać się ze specyfikacjami producenta urządzenia lub skontaktować się z inżynierem serwisu. Aby wymienić uszczelki, należy zapoznać się z sekcją konserwacji w instrukcji obsługi pompy lub ponownie skontaktować się z inżynierem serwisu.

Odblokowanie filtra kolumny

Zatkany filtr kolumny to kolejny częsty problem HPLC. Aby zminimalizować ten problem od samego początku, należy używać filtra przedkolumnowego i kolumny ochronnej. Aby wyczyścić wlot, najpierw odłącz i odwróć kolumnę. Podłącz ją do pompy (ale nie do detektora) i przepompuj rozpuszczalnik z dwukrotnością standardowego natężenia przepływu. Około 5-10 objętości rozpuszczalnika w kolumnie powinno wystarczyć do usunięcia niewielkich ilości cząstek stałych z fryty wlotowej. Oceń wydajność oczyszczonej kolumny przy użyciu standardowej mieszaniny testowej.

WYBÓR PRODUKTÓW DO OCHRONY KOLUMN

Supelco^® Aparat do filtracji fazy ruchomej (podłączany do linii aspiracyjnej)

• Aparat do filtracji 1 (podłączany do kolby bocznej o pojemności 1000 ml): Zawiera szklany zbiornik o pojemności 250 ml, podstawę lejka i korek, zacisk, uchwyt i sito ze stali nierdzewnej, 10 uszczelek teflonowych, 50 filtrów Nylon 66 (47 mm, pory 0,45 μm).
• Aparat do filtracji 2 (podłączany do linii aspiracyjnej): Zawiera szklany zbiornik 250 ml, stożkową podstawę lejka 34/45, stożkową kolbę 1000 ml 34/45 i szklaną nasadkę, zacisk, uchwyt i sito ze stali nierdzewnej, 10 uszczelek teflonowych, 50 filtrów Nylon 66 (47 mm, pory 0,45 μm).

Chroń swój instrument i kolumny, usuwając cząsteczki i gazy z rozpuszczalników i innych składników fazy ruchomej. Filtry membranowe Nylon 66 są kompatybilne ze wszystkimi rozpuszczalnikami powszechnie stosowanymi w HPLC.

Filtry

Filtr przedkolumnowy jest niezbędny do ochrony kolumn HPLC przed cząstkami stałymi, które mogą gromadzić się na frycie kolumny, prowadząc do rozszczepienia pików i wysokiego przeciwciśnienia. Źródłem cząstek stałych są fazy ruchome (zwłaszcza gdy bufory są mieszane z rozpuszczalnikami organicznymi), uszczelki pomp i wtryskiwaczy oraz próbki. Do ochrony kolumn zawierających cząstki o wielkości 5 μm lub większe należy używać filtra 2,0 μm, a w przypadku kolumn z cząstkami mniejszymi niż 5 μm - filtra 0,5 μm.

Nasz filtr przedkolumnowy Supelco^®  może być podłączony bezpośrednio, ręcznie szczelnie, do dowolnej kolumny HPLC lub kolumny ochronnej wymienionej na naszej stronie internetowej lub do dowolnej innej kolumny wyposażonej w złącza końcowe zgodne z Valco. Nasadka i korpus z PEEK, fryta ze stali nierdzewnej 2 μm. 

>

Valco Precolumn Frit and Screen Filters³

Instalacja w linii. Wydajne filtry o niskiej objętości martwej chronią kolumny przed cząstkami stałymi bez zmniejszania wydajności kolumny. Wymienny fryt 1/8" ma pory 0,5 μm, aby chronić pakiety kolumn 3 μm lub 5 μm, wymienny ekran ma pory 2 μm. Wybierz filtr frytowy, aby uzyskać wyższą wydajność filtracji (większość zastosowań) lub filtr sitowy, aby uzyskać mniejszą objętość martwą (np. w przypadku kolumn z mikrootworami). Używaj z rurkami o średnicy zewnętrznej 1/16 cala; w zestawie złączki 1/16 cala.

Filtr przedkolumnowy Isolation Technologies

Instalacja w linii. Filtr wlotowy o dużej pojemności minimalizuje objętość martwą i poszerzenie pasma, aby zapobiec utracie wydajności kolumny, jednocześnie chroniąc kolumnę. Porowatość filtra: 0,5 μm. Komplet jak na ilustracji.

Wysokociśnieniowy filtr przedkolumnowy SSI

Instalacja w linii. Dysk filtra ze stali nierdzewnej 316 (pory 0,5 μm) można łatwo wymienić bez konieczności demontażu końcówki kolumny. Maksymalne ciśnienie robocze: 15 000 psi (1054 kg/cm²). Dla rurek 1/16"

Wysokociśnieniowy filtr wstępny SSI

Umieść między pompą a wtryskiwaczem, aby zapewnić końcową filtrację fazy ruchomej. Łatwo wymienialny element filtrujący ze stali nierdzewnej 316 (pory 0,5 μm). Maksymalne ciśnienie robocze: 15 000 psi (105 MPa). Do rurek o średnicy zewnętrznej 1/16 cala, gwinty 10-32

Filtr przedkolumnowy Upchurch

Instalacja w linii. Korpus ze stali nierdzewnej z obojętnymi złączami końcowymi z polieteroeteroketonu (PEEK) i frytą PEEK 0,5 μm lub 2 μm w jednym złączu końcowym.

Wtryskiwacze Rheodyne Model 7725 i 7725i

Wtryskiwacz Rheodyne Model 7725 umożliwia wstrzykiwanie próbek o objętości od 1 μL do 5 ml z dokładnością i precyzją. Wytrzymała, łatwa w utrzymaniu konstrukcja oferuje wiele zaawansowanych funkcji:

• Opatentowana, ciągła konstrukcja przepływu (patrz rysunek) - przepływ jest nieprzerwany po przełączeniu z LOAD na INJECT
• Łatwa regulacja uszczelnienia za pomocą śruby dociskowej z przodu wtryskiwacza.
• Szeroki kąt portu (30 °), zapewniający łatwy dostęp do złączek

Dozownik zawiera pętlę na próbkę o pojemności 20 μL i jest dostarczany z uszczelką wirnika VESPEL, którą można zastąpić uszczelką wirnika Tefzel do pracy przy pH 0-14. Fabrycznie ustawiony na 5000 psi (345 bar), regulowany do 7000 psi (483 bar). Model 7725i posiada wewnętrzny przełącznik położenia.

Konwencjonalny zawór HPLC chwilowo przerywa przepływ podczas wstrzykiwania próbki, narażając kolumnę na powtarzające się wstrząsy ciśnieniowe. Opatentowana przez Rheodyne konstrukcja MBB (make-before-break) tworzy nowe połączenie przed zerwaniem starego, zapewniając nieprzerwany przepływ.

Rheodyne Model 7725 injector. 1. To sample loop, 2 From pump, 3. MBB passage, 4. MBB port, 5. To column, 6. From sample loop

Części zamienne do pomp Optimize Technologies

Program konserwacji zapobiegawczej, który obejmuje rutynową wymianę części pompy, które ulegają zużyciu, pomoże uniknąć kosztownych przestojów. Nasz szeroki wybór zaworów zwrotnych, uszczelek i tłoków Optimize Technologies spełnia lub przewyższa specyfikacje producentów pomp. Najbardziej aktualny wybór części do pomp można znaleźć na stronie internetowej.

Tłumik impulsów SSI^™ LO-Pulse^™

Tłumik impulsów kontroluje pulsacje pompy, zapewniając bardziej stabilną linię bazową. Tłumik SSI^™ LO-Pulse^™ jest opatentowanym urządzeniem kompatybilnym z jednotłokowymi pompami tłokowymi HPLC (Altex 110A, pompy Eldex, LDC Mini-Pump VS, SSI Modele 200 i 300, itp.) Przy ciśnieniu od 500 psi do 6000 psi (35-420 kg/cm²) poprawia precyzję analiz ilościowych i limity wykrywania śladowych składników próbki. Złączki i instrukcje w zestawie.