Jest to jeden z najbardziej krytycznych etapów podczas przygotowywania białek błonowych. Podczas etapu solubilizacji, białka błonowe są ekstrahowane z ich naturalnego środowiska, błony lipidowej, do środowiska wodnego przy użyciu detergentów. Detergenty działają poprzez dezintegrację dwuwarstwy lipidowej, jednocześnie włączając lipidy i białka do miceli detergentowych.
Hydrofobowe obszary powierzchni białek błonowych i "ogony" lipidów są zakopane w hydrofobowym wnętrzu struktur micelarnych detergentu, podczas gdy hydrofilowe części białek są w kontakcie ze środowiskiem wodnym (rys. 1.1). Skuteczna solubilizacja rozdziela większość interakcji lipid-białko i białko-białko, umożliwiając w ten sposób oddzielenie białek.
Białko docelowe można oczyścić w obecności detergentu, stosując zasadniczo dowolną z istniejących technik oczyszczania białek dostępnych dla białek rozpuszczalnych. Udany protokół solubilizacji ekstrahuje białko błonowe z wysoką wydajnością i skutkuje stabilnymi kompleksami białko-detergent (lub kompleksami białko-lipid-detergent), w których białko zachowuje swoją aktywną konformację.
Niektóre białka błonowe wymagają interakcji z natywnymi lipidami z dwuwarstwy lipidowej lub dodanymi egzogennymi lipidami, aby pozostać w swojej aktywnej konformacji. W takich przypadkach istotne jest, aby protokół solubilizacji umożliwiał tworzenie stabilnego kompleksu białko-lipid-detergent i aby nie usuwał wymaganych natywnych lipidów związanych z białkiem docelowym. Surowe procedury solubilizacji i oczyszczania mogą prowadzić do usunięcia takich niezbędnych lipidów, a tym samym inaktywacji białka.
Rysunek 1.1.Schematyczny rysunek detergentowej solubilizacji białek błonowych. Białka błonowe są przenoszone z naturalnej dwuwarstwy lipidowej (niebieski i żółty) do kompleksów z detergentem (zielony) i, w niektórych przypadkach, lipidami. Pokazano również micelę lipidowo-detergentową, micelę detergentową i wolny detergent.
Detergenty i CMC
Detergenty to substancje amfipatyczne z polarną (hydrofilową) grupą główną i niepolarnym (hydrofobowym) ogonem. Część polarna może być niejonowa, anionowa, kationowa lub zwitterionowa, a detergenty są często odpowiednio klasyfikowane (tj. detergent z anionową częścią polarną jest określany jako detergent anionowy). Zalety i wady różnych klas detergentów są wymienione w Tabeli 1.3.
.
Powyżej pewnego stężenia w środowisku wodnym cząsteczki detergentów łączą się, tworząc wielocząsteczkowe kompleksy, micele, z hydrofobowymi wnętrzami i hydrofilowymi powierzchniami. Stężenie to określane jest jako krytyczne stężenie micelarne (CMC). CMC jest różne dla różnych detergentów, a także zmienia się w zależności od pH, temperatury i siły jonowej.
Ogólnie rzecz biorąc, wszystkie bufory i roztwory stosowane do preparatów białek błonowych (do solubilizacji, oczyszczania, przechowywania itp.) powinny mieć stężenie detergentu powyżej CMC.
W tabeli 1.4 wymieniono kilka detergentów, które są zalecane do solubilizacji białek błonowych. Struktury chemiczne kilku przykładowych detergentów z różnych klas zostały przedstawione na Rysunku 1.4.
1N = niejonowy; Z = zwitterionowy
2W temperaturze od 20 °C do 25 °C i ~50 mM Na+
Rysunek 1.4.Struktury chemiczne wybranych detergentów z różnych klas.
Skrining detergentów
W celu ustalenia najlepszych warunków dla każdego białka błonowego należy przetestować kilka różnych detergentów i warunków. Wydajność solubilizacji jest monitorowana poprzez oznaczanie docelowego białka błonowego w rozpuszczonej frakcji. W poniższym protokole nierozpuszczony materiał jest usuwany przez ultrawirowanie.
Możliwe jest również zastosowanie nieklarownego solubilizatu bezpośrednio do specjalnie zaprojektowanych kolumn chromatograficznych lub płytek wielodołkowych, które mogą obsługiwać pozostałości komórkowe (Przeprowadzenie badań na małą skalę expression screening of histidine-tagged membrane proteins from E. coli lysates). Filtracja może być również stosowana do klaryfikacji.
Wykrywanie białek może być wykonywane przez Western blot po SDS-PAGE. W przypadku białek o niskiej ekspresji, przed wykryciem białka może być wymagany etap wzbogacania chromatograficznego (Conditioning). W przypadku białek o wysokiej ekspresji, wydajność solubilizacji można oszacować za pomocą SDS-PAGE z barwieniem błękitem Coomassie.
Oprócz określenia wydajności i jednorodności, często konieczne jest monitorowanie aktywności białka, która jest najlepszym wskaźnikiem nienaruszonej struktury (i funkcji) białka. W przypadku niektórych białek błonowych testy funkcjonalne można zastosować do białka rozpuszczonego w detergencie. W innych przypadkach, ponowne umieszczenie białka błonowego w sztucznej dwuwarstwie lipidowej (rekonstytucja białka błonowego) jest konieczne do przeprowadzenia testu funkcjonalnego.
Ogólna procedura przesiewowa z użyciem detergentów
Przygotowanie buforu
PBS: 10 mM fosforan, 2,7 mM KCl, 137 mM NaCl, pH 7,4
Bufor Tris: 20 mM przy neutralnym pH Tabela 1.5. Dodatki do PBS lub buforu Tris do badań przesiewowych detergentów
Lista zalecanych detergentów znajduje się w Tabeli 1.4.
Solubilizacja
- Zaczynając od preparatu membranowego o znanym stężeniu białka, połącz materiały zgodnie z Tabelą 1.5, aby uzyskać całkowitą objętość 1 ml. Inkubować z delikatnym mieszaniem w żądanej temperaturze przez wskazany czas.
- Wirować z prędkością 100 000 × g w temperaturze 4°C przez 45 minut.
- Przeprowadź test supernatantu na obecność białka docelowego. Ogólne testy, które można zastosować to SDS-PAGE (Przeprowadzanie kontroli czystości i jednorodności), szybkie oczyszczanie afityczne, a następnie filtracja żelowa (Przeprowadzanie kontroli czystości i jednorodności) i testy specyficzne dla znacznika zgodności (np, dot blot przy użyciu przeciwciał specyficznych dla znacznika). Należy również rozważyć testy aktywności białek błonowych.
Protokół badania przesiewowego ekspresji w Przeprowadzenie na małą skalę badanie ekspresji białek błonowych znakowanych histydyną z lizatów E. coli można dostosować do połączonego badania przesiewowego solubilizacji i protokołu badania wiązania.
Wyniki wstępnego badania przesiewowego solubilizacji EM29, białka błonowego znakowanego histydyną Mr 29 000 z E. coli, pokazano na rysunku 1.5. Silne pasmo w oczekiwanej pozycji dla białka docelowego wskazuje na wysoką ekspresję i/lub skuteczną solubilizację. FC12, Triton X-100 i LDAO dały słabsze pasma niż inne testowane detergenty. Stwierdzono zatem, że te detergenty były mniej odpowiednie do solubilizacji tego białka. Należy również stwierdzić, że wysoka lub rozsądna wydajność musi być połączona z zachowaniem aktywności i stabilności w roztworze detergentu po solubilizacji - co jest kolejną analizą przesiewową, którą należy wziąć pod uwagę.
Rysunek 1.5.Analiza za pomocą SDS-PAGE i barwienia błękitem Coomassie połączonego badania przesiewowego ekspresji i wstępnego badania przesiewowego solubilizacji EM29. Przetestowano osiem różnych detergentów, a elucję przeprowadzono w dwóch etapach (odpowiednio w lewej i prawej połowie żelu). FC12 = FOS-Choline 12; UDM = undecyl maltoside; DDM = dodceyl maltoside; OG = octyl glucoside; TX-100 = Triton X-100; LDAO = lauryl dimethylamine oxide. Dane uprzejmie dostarczone przez dr Saida Eshaghi, Karolinska Insitute, Sztokholm, Szwecja.
Specyficzne lipidy mogą być związane z białkiem w natywnej błonie, a ich obecność może być niezbędna dla aktywności białka. Zachowanie aktywności wymaga, aby te lipidy były nadal obecne po solubilizacji i oczyszczeniu. Surowe warunki solubilizacji i oczyszczania mogą prowadzić do usunięcia takich lipidów, powodując inaktywację białka błonowego.
DDM jest często dobrym detergentem do wypróbowania we wstępnych testach solubilizacji.
CHAPS i digitonina działają szczególnie dobrze w przypadku solubilizacji białek błonowych z Pichia pastoris.
Skrining solubilizacji białek błonowych znakowanych GST produkowanych w E. coli
Metoda opisana poniżej (Rysunek 1.6.) zapewnia prostą i szybką metodę wyboru optymalnych warunków solubilizacji w celu uzyskania najwyższej wydajności białka błonowego znakowanego GST. Ta procedura przesiewowa opiera się na odporności GST na pożywkę Glutathione Sepharose 4B. Detergenty wybrane do badań przesiewowych nie mogą wpływać na aktywność wiązania GST.
Rysunek 1.6.Test przesiewowy detergentu dla białka błonowego znakowanego GST.
Materiały
Moduł detekcji GST
Moduł oczyszczania GST SpinTrapTM
Moduł oczyszczania GST MultiTrap 4B
Bufor wiążący: 10 mM fosforan, 2,7 mM KCl, 137 mM NaCl, pH 7,4 (PBS)
Bufor elucyjny: Bufor wiążący uzupełniony 0.2% (w/v) detergentu i 10 mM zredukowanego glutationu
Solubilization screening
.Jeśli aktywność enzymatyczna GST (jako wskaźnik aktywności wiązania GST) w obecności wybranych detergentów jest nieznana, należy ocenić aktywność GST w detergentach przy użyciu testu CDNB dostarczonego w module wykrywania GST. Porównaj aktywność GST w obecności i nieobecności każdego detergentu. Wiadomo, że GST jest w pełni aktywny w DDM, CHAPS, glukozydzie oktylu, Tween 20, Triton X-100, Brij35 i NP 40 w stężeniach detergentu od 0,3 do 10 razy CMC dla każdego detergentu.
- Rozbij komórki poprzez traktowanie lizozymem w połączeniu z zamrażaniem i rozmrażaniem i wyizoluj błony poprzez wirowanie przy ~50 000 × g przez 30 minut w temperaturze 4 °C (patrz "Przygotowanie błon z E. coli" w Performing a cell disruption and membrane preparation). Większa prędkość i dłuższy czas wirowania (np, 100 000 × g przez 60 minut) mogą być wymagane, jeśli stosowane są bardziej rygorystyczne metody rozrywania komórek.
- Rozpuścić osad membrany (1:10 w/v) w 5% (w/v) roztworach detergentów przez 2 godziny na lodzie z łagodnym mieszaniem (patrz "Przesiewanie detergentów" dalej w celu uzyskania dodatkowych informacji).
- Klarować przez wirowanie z prędkością ~50 000 × g przez 30 minut w temperaturze 4 °C (lub z prędkością 18 000 × g przez 60 minut w temperaturze 4 °C).
- Zdekantować 500 µl supernatantu i oczyścić za pomocą modułu oczyszczania GST SpinTrap lub GST MultiTrap 4B zgodnie z dostarczonymi instrukcjami. Elucja przy użyciu 500 µL buforu elucyjnego. Oznaczyć aktywność GST za pomocą GST Detection Module.
- Analiza za pomocą SDS-PAGE (patrz Przeprowadzanie kontroli czystości i jednorodności).
Optymalizacja warunków solubilizacji
Po ustaleniu początkowych warunków solubilizacji, warunki można zoptymalizować poprzez dalsze badania przesiewowe z jednym lub ograniczoną liczbą detergentów. Przydatne parametry przesiewowe do zbadania to:
- stosunek stężenia białka do stężenia detergentu. Stężenia białek w zakresie od 1 do 10 mg/ml są typowe
- czas solubilizacji i warunki mieszania (np,
- pH
- siła jonowa
Jednorodność wielkości może być stosowana jako wskaźnik stabilności (a tym samym optymalnych warunków solubilizacji), ponieważ białka błonowe często ulegają oligomeryzacji lub agregacji, gdy są destabilizowane. Jednorodność wielkości można szybko ocenić za pomocą SuperdexTM 200 5/150 GL (patrz "Charakterystyka jednorodności wielkości" w Przeprowadzanie kontroli czystości i jednorodności). Rysunek 1.7 pokazuje, w jaki sposób SuperdexTM 200 5/150 GL (objętość kolumny 3 ml) może być używany do badania jednorodności w różnych warunkach pH i zasolenia.
Rysunek 1.7.Badanie warunków pH i siły jonów dla optymalnej jednorodności i stabilności kompleksu detergent-białko. Szybka filtracja żelowa przy użyciu Superdex 200 5/150 GL wykazała symetryczny pik, gdy separację przeprowadzono przy pH 5,2 w 0,1 M NaCl (A), co wskazuje na homogeniczne białko w tych warunkach. Przy nieco wyższym stężeniu soli (D) niewielki pik pojawił się w pobliżu objętości pustej przestrzeni, wskazując, że oligomeryzacja lub agregacja pojawiły się w ograniczonym zakresie. Zarówno przy pH 7,5, jak i pH 9,5 uzyskano znaczące piki w pobliżu objętości pustej przestrzeni, co wskazuje na silną oligomeryzację lub agregację. Pełna procedura przesiewowa została osiągnięta w ciągu zaledwie kilku godzin, w tym czas na wyrównanie kolumny. Zużycie próbki wynosiło 6 × 10 µL dla pełnego badania przesiewowego. Dane uprzejmie dostarczone przez dr Saida Eshagi, Karolinska Institute, Sztokholm, Szwecja.
Można również rozważyć mieszaniny detergentów.
Dodatki takie jak lipidy i małe amfifile (np. 1,2,3-heptanetriol) lub znane ligandy dla białka docelowego mogą być przydatne do testowania. Małe amfifile mogą wpływać na zachowanie krystalizacji poprzez zmianę wielkości miceli detergentu. Uważa się, że ligandy zmniejszają dynamikę struktury białka, a tym samym stabilizują białko w roztworze detergentu.
Solubilizacja do oczyszczania
Po optymalizacji protokół solubilizacji jest wykonywany w skali odpowiedniej do ilości białka błonowego, które należy uzyskać.
Zaleca się kontynuowanie oczyszczania natychmiast po solubilizacji, aby zminimalizować utratę aktywności białka błonowego z powodu agregacji, utraty struktury lub degradacji proteolitycznej.
Detergent, który działa dobrze do solubilizacji określonego białka błonowego, może być mniej odpowiedni do innych operacji z tym samym białkiem (np. krystalizacji), krystalizacja). Procedury wymiany detergentów opisano w Kondycjonowanie.
Solubilizacja rozpuszczalnikami organicznymi
Małe i stabilne białka błonowe są czasami możliwe do ekstrakcji z dwuwarstwy lipidowej w ich aktywnej formie przy użyciu rozpuszczalników organicznych. Na przykład, 110 aminokwasowe białko błonowe ekstrahowano z E. coli mieszaniną chloroformu i metanolu, a wstępne oczyszczanie ekstraktu przeprowadzono w tym środowisku przy użyciu odpornego na rozpuszczalniki organiczne podłoża chromatograficznego i kolumny (rysunek 1.8; 13). W przypadku tego białka błonowego stosunek chloroformu do metanolu 1:1 dał najlepszą separację.
Rysunek 1.8.Separacja metodą filtracji żelowej białek błonowych ekstrahowanych rozpuszczalnikiem. Linia ciągła = ekstrakt organiczny błon E. coli, w których EmrE (białko transportera oporności wielolekowej) uległo nadekspresji; linia przerywana = ekstrakt organiczny "pustych" błon E. coli. Zastosowano dwie proporcje chloroformu (C) i metanolu (M). Gwiazdka oznacza piki zawierające EmrE. Użyto za zgodą. Copyright 2002 Elsevier Science (USA) Publikacja.
Rysunek 1.13.Charakterystyka jednorodności wielkości białek błonowych za pomocą filtracji żelowej. Oczyszczanie IMAC trzech białek błonowych E. coli analizowano za pomocą filtracji żelowej przy użyciu Superdex 200. Każde białko oczyszczono oddzielnie metodą IMAC w obecności dwóch różnych detergentów. Analizę filtracji żelowej przeprowadzono przy użyciu tego samego detergentu, który został użyty do oczyszczania. Symetryczny pik (który nie znajduje się w pustej objętości), jak na chromatogramie C, pokazuje, że białko nie uległo agregacji, co wskazuje, że oczyszczanie zakończyło się powodzeniem. Niebieska linia = ślad A280. Użyto za zgodą. Copyright 2005 The Protein Society.
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?