Procedury ELISA

• Bezpośredni test ELISA
  
• Przechwytujący test ELISA

Pośredni test ELISA

Odczynniki i sprzęt

1. Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS) w tabletkach: 10 mM bufor fosforanowy, pH 7,4, 150 mM NaCl (produkt nr  P4417) i 0,1% azydek sodu (produkt nr  S2002).
2. Kapsułka buforu wodorowęglanowo-węglanowego, pH 9,6 (nr produktu  C3041).
3. Bufor myjący (PBS-T): 10 mM bufor fosforanowy pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20 (Product No. P3563).
4. Pierwotne przeciwciało monoklonalne.
5. Przeciwciała kontrolne: dopasowane gatunkowo i izotypowo, niespecyficzne immunoglobuliny (np, białka szpiczaka myszy jako kontrola dla mysiego monoklonalnego przeciwciała pierwotnego)
6. Przeciwciało wtórne sprzężone z fosfatazą alkaliczną lub przeciwciało wtórne sprzężone z peroksydazą
7. Substrat dla przeciwciała wtórnego sprzężonego z fosfatazą alkaliczną (taki jak tabletki SIGMAFAST™ pNPP, nr produktu. N1891) lub substrat dla drugorzędowego przeciwciała sprzężonego z peroksydazą (taki jak tabletki SIGMAFAST™ OPD, nr produktu. P9187).
8. Odczynnik zatrzymujący dla fosfatazy alkalicznej: 3 M NaOH (opcjonalnie) lub odczynnik zatrzymujący dla peroksydazy: 3 M HCl lub 3 M H₂SO₄ (opcjonalnie).
9. Płytki mikrotitracyjne
10. Czytnik płytek mikrotitracyjnych wyposażony w filtr 405 nm lub 450/492 nm (odpowiednio dla pNPP lub OPD).
    

Procedura

• Powlekanie antygenem
  
• Reakcja przeciwciała pierwotnego
  
• Zastosowanie przeciwciała wtórnego
  
• Przygotowanie substratu
  
• Rozwój

Antigen Coating

1. Przygotuj roztwór antygenu o odpowiednim stężeniu w buforze węglanowo-wodorowęglanowym lub PBS.
2. Nanieść pipetą 0,2 ml powyższego roztworu do każdej studzienki płytki mikrotitracyjnej.
3. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut, lub inkubować (pod przykryciem) przez noc w temperaturze 4 °C.
4. Usuń roztwór powlekający. Przemyć trzykrotnie PBS-T.
   
   Uwaga: Jeśli wystąpią problemy z niespecyficznym wiązaniem, może być wymagany dodatkowy etap blokowania (30 min. 5% BSA-PBS). Więcej informacji można znaleźć w: Vogt, R.F., et al., J. Immunol. Meth., 101, 43 (1987).

Primary Antibody Reaction

1. Pierwotne przeciwciało monoklonalne rozcieńczyć w PBS-T. Optymalne rozcieńczenie należy określić za pomocą testu miareczkowania.
2. Dodaj 0,2 ml rozcieńczonego przeciwciała monoklonalnego do każdej studzienki. Kontrolą negatywną powinna być dopasowana gatunkowo i izotypowo, niespecyficzna immunoglobulina rozcieńczona w PBS-T.
3. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
4. Przemyć jak w kroku 4 Powlekania antygenem.

Application of Secondary Antibody

1. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe sprzężone z enzymem w PBS-T. Dodać 0,2 ml tego roztworu do każdego dołka. Optymalne rozcieńczenie należy określić za pomocą testu miareczkowania.
2. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
3. Umyć jak w kroku 4 Powlekania antygenem.

Przygotowanie podłoża

.

1. Podczas ostatniej inkubacji i bezpośrednio przed użyciem należy przygotować substrat enzymatyczny lub doprowadzić gotowy substrat płynny do temperatury pokojowej.

Development

1. Dodaj 0.2 ml świeżo przygotowanego podłoża do każdej studzienki.
2. Kolor powinien pojawić się w studzienkach pozytywnych po 30 minutach (żółty lub pomarańczowy, odpowiednio dla pNPP lub OPD).
3. Absorbancję można odczytać bezpośrednio w czytniku mikropłytek (przy 405 nm lub 450 nm, odpowiednio dla pNPP lub OPD) lub reakcję można zatrzymać za pomocą 50 µL na studzienkę odpowiedniego odczynnika zatrzymującego, a absorbancję odczytać później (przy 405 nm lub 492 nm, odpowiednio dla pNPP lub OPD).

Capture ELISA

Capture ELISA (znany również jako "sandwich" ELISA) jest czułym testem do ilościowego oznaczania od pikogramów do mikrogramów substancji (takich jak hormony, substancje chemiczne sygnalizujące komórki, antygeny chorób zakaźnych i cytokiny).). Ten typ testu ELISA może być potrzebny zamiast bezpośredniego lub pośredniego testu ELISA z kilku powodów. Analizowana substancja może być zbyt rozcieńczona, aby związać się z polistyrenową płytką mikromiareczkową (np. białko w supernatancie hodowli komórkowej) lub nie wiąże się dobrze z tworzywami sztucznymi (np. mała cząsteczka organiczna). Może być zmieszany ze zbyt wieloma innymi substancjami, aby dobrze związać się z płytką, dwa zestawy Sigma, które opisują lub wykorzystują wychwytywanie ELISA to zestaw TNF-alfa i zestaw odczynników do izotypowania myszy (nr produktu. ISO2).

Odczynniki i sprzęt

1. Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS): 10 mM bufor fosforanowy, pH 7,4, tabletka 150 mM NaCl (nr produktu  P4417) i 0,1% azydek sodu (nr produktu. S2002)
2. Kapsułka buforu węglanowo-wodorowęglanowego, pH 9.6 (Nr produktu  C3041)
3. Bufor myjący (PBS-T): 10 mM bufor fosforanowy pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20 (Product No. P3563)
4. Przeciwciało wychwytujące lub powlekające
5. Antygen kontrolny, który ma być użyty do krzywej standardowej
6. Znakowane przeciwciało wykrywające
7. Substrat. Zazwyczaj stosuje się najbardziej czuły substrat (taki jak TMB lub OPD w przypadku stosowania peroksydazy jako enzymu znakującego).
8. Roztwór zatrzymujący (opcjonalnie)
9. Płytki mikrotitracyjne
10. Czytnik płytek mikrotitracyjnych
    

Procedura

• Powlekanie przeciwciała wychwytującego
  
• Aplikacja kontroli i próbek
  
• Aplikacja przeciwciała detekcyjnego

Uwaga:Jest to protokół ogólny. Optymalne rozcieńczenia dla przeciwciała wychwytującego, próbek, kontroli i przeciwciał wykrywających, a także czasy inkubacji będą musiały zostać określone empirycznie i mogą wymagać intensywnego miareczkowania. Najlepiej byłoby użyć przeciwciała wykrywającego znakowanego enzymem, jak opisano w tej procedurze. Jeśli jednak przeciwciało wykrywające jest nieznakowane, przeciwciało drugorzędowe nie może reagować krzyżowo ani z przeciwciałem powlekającym, ani z próbką. Należy również uwzględnić odpowiednie kontrole negatywne i pozytywne.

Powlekanie przeciwciała wychwytującego

1. Odpowiednio rozcieńczyć przeciwciało wychwytujące lub powlekające w buforze węglanowo-wodorowęglanowym lub PBS. Przeciwciała wychwytujące są zwykle umieszczane w stężeniu od 0,2 do 10 µg/ml. Zaleca się stosowanie przeciwciał oczyszczonych metodą powinowactwa lub co najmniej frakcji IgG.
2. Nanieść pipetą 0,2 ml rozcieńczonego przeciwciała wychwytującego do każdej studzienki płytki mikromiareczkowej.
3. Inkubować płytkę (przykrytą) przez 1 godzinę w temperaturze 37°C.
4. Usuń roztwór powlekający. Przepłucz płytkę 3 razy buforem płuczącym (PBS-T).

Zastosowanie kontroli i próbek

1. Dodaj 0.2 ml odpowiednio rozcieńczonych próbek i kontroli do odpowiednich studzienek. Zazwyczaj próbki są rozcieńczane w PBS w zakresie 10 ng-10 µg/dołek (im bardziej czuły test, tym mniej próbki jest wymagane).
2. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
3. Usuń próbkę lub roztwór kontrolny. Przepłucz płytkę 3 razy buforem płuczącym (PBS-T).

Zastosowanie przeciwciała wykrywającego

1. Rozcieńczyć znakowane enzymatycznie przeciwciało wykrywające.
2. Nanieść pipetą 0,2 ml odpowiednio rozcieńczonego przeciwciała wykrywającego do każdej studzienki.
3. Ikubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
4. Usuń roztwór przeciwciała wykrywającego. Przemyć płytkę 3 razy buforem płuczącym (PBS-T).
5. Dodać odpowiedni roztwór substratu.
6. Pozwolić płytce rozwinąć się (zwykle 30 minut) i dodać roztwór zatrzymujący (opcjonalnie).
7. Odczytać absorbancję przy odpowiedniej długości fali w czytniku mikropłytek.

Referencje

1. Harlow E, Lane D. 1988. Antibodies: A Laboratory Manual. 1. New York: Cold Spring Harbor Larboratory Press.

2. Hornbeck P. 1992. Enzyme-Linked Immunosorbent Assays. Current Protocols in Immunology. 1(1):2.1.1-2.1.22. https://doi.org/10.1002/0471142735.im0201s01

3. Crowther JR. Basic Immunology.1-34. https://doi.org/10.1385/0-89603-279-5:1

4. Deshpande SS. 1996. Enzyme Immunoassays. https://doi.org/10.1007/978-1-4613-1169-0

5. 1996. Immunoassay. Elsevier.

6. Feren?ík M. 1993. Handbook of Immunochemistry. https://doi.org/10.1007/978-94-011-1552-0

7. Tijssem P. 1985. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Practice and Theory of Enzyme Immunoassays. 15. Elsevier B.V.