Rekombinowana DNaza I, protokół wolny od RNazy

Nr produktu. 04716728001

Protokół

Usuwanie DNA z reakcji RT-PCR:

Przegląd

DNaza I z trzustki bydlęcej jest glikoproteiną o Mr 37000. W celu usunięcia RNaz z preparatu DNazy stosuje się specjalną procedurę. DNaza I jest endonukleazą specyficzną dla DNA, która hydrolizuje ds lub ssDNA do mieszaniny oligo i mononukleotydów. Enzym wymaga kationów dwuwartościowych dla maksymalnej aktywności. Specyficzność reakcji zależy od rodzaju kationów. W obecności Mg²⁺ DNaza I powoduje nacięcia w dsDNA, podczas gdy w obecności Mn²⁺ enzym wytwarza dwuniciowe przerwy.

Sugerowana metoda usuwania DNA do RT-PCR

10 x bufor reakcyjny: 200 mM Tris-HCl, pH 8,3 500 mM KCl 10 mM MnCl₂ zaleca się dodanie 20 U Protector RNase Inhibitor;
Dodać 1 U DNazy I, wolnej od RNazy na 1 μg całkowitego RNA i inkubować przez 30 min w temperaturze +25 °C.

Zatrzymać reakcję przez ekstrakcję fenolem/chloroformem, a następnie wytrącenie etanolem (alternatywnie, zatrzymać reakcję przez ogrzewanie przez 5 minut w temperaturze +75 °C, ale należy pamiętać, że podwyższona temperatura może uszkodzić RNA).

Uwaga: RT-PCR w jednej probówce

Usuwanie Mn²⁺ buforu i enzymu jest konieczne, aby uniknąć zakłóceń w jednoetapowym RT-PCR z systemem Titan-One-Tube RT-PCR. W takim przypadku można zastosować alternatywną metodę:

1. Rozpuścić 1 μg RNA w 40 mM Tris, pH 8, 10 mM MgSO₄, 1 mM CaCl₂
2. Dodać 6 U DNazy I, wolnej od RNazy i 20 U Inhibitora RNAzy Protector.
3. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze +37°C

Inaktywować przez 5 minut w temperaturze +90°C, odwirować przez krótkie wirowanie i natychmiast inkubować na lodzie

.