Protokół oczyszczania wirusowego RNA przy użyciu zestawów GenElute™ do oczyszczania całkowitego RNA ssaków

Tylko do użytku badawczego; nie do użytku w procedurach diagnostycznych. Ten protokół dotyczy numerów katalogowych RTN70 i RTN350.

Zestaw GenElute^™ Mammalian Total RNA Purification Kit zapewnia szybką metodę izolacji i oczyszczania całkowitego RNA z wirusów, takich jak nowy koronawirus 2019 (SARS-CoV-2), który wywołuje chorobę COVID-19. Oczyszczanie opiera się na chromatografii kolumnowej z wykorzystaniem żywicy krzemionkowej jako matrycy separacyjnej. Poniższy protokół jest zalecany do oczyszczania wirusowego RNA z próbek bezkomórkowych, w tym surowic, osocza oraz wymazów z nosa i gardła.

Przygotowanie odczynników

Wymagane materiały:

• GenElute^™ Mammalian Total RNA Purification Kit (RTN70 lub RTN350)
• 96-100% etanol (niedenaturujący)
• Woda wolna od RNaz
• Nośnik RNA Poly-A
• Mikrowirówka
• Sterylna, wolna od RNAzy/DNazy końcówki do pipet i probówki

Zanim zaczniesz:

1. Oczyść przestrzeń roboczą
2. Przygotuj nośnikowy RNA Poly-A
   • Zawieś liofilizowany nośnikowy RNA z buforem lizującym do stężenia 1 µg/µL i podziel na podwielokrotności 20 µL. Przechowywać podwielokrotności zamrożone w temperaturze -20 °C. Unikać zamrażania i rozmrażania.
3. Przygotuj bufor do lizy
   • Określ ile buforu do lizy będziesz potrzebować. Użyj 500 µL buforu do lizy na każde 120 µL próbki osocza. Próbki mogą wymagać zagęszczenia.
   • Dodaj 10 µL/mL β-merkaptoetanolu (BME) do buforu do lizy
   • Dodaj 10 µL/mL nośnikowego RNA do buforu do lizy
     • Może być konieczne dostosowanie ilości nośnikowego RNA do danego zastosowania
   • Worteksować bufor lizujący w celu wymieszania

Protokół ekstrakcji RNA dla próbek surowicy i osocza

1. Pipetować 500 µL przygotowanego buforu lizującego zawierającego β-merkaptoetanol i nośnik RNA do 1.
   • Jeśli objętość próbki jest większa niż 120 µL, zwiększ proporcjonalnie ilość buforu lizującego.
2. Dodaj 120 µL osocza lub płynu bezkomórkowego. Wymieszać przez pulsacyjne worteksowanie przez 10 sekund.
3. Wirować probówki przez chwilę z małą prędkością.
4. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
5. Dodać 500 µL 100% etanolu. Wymieszaj przez pulsacyjne worteksowanie przez 10 sekund.
   • Nie używaj skażonego alkoholu
   • Jeśli objętość próbki jest większa niż 120 µL, zwiększ proporcjonalnie objętość etanolu.
6. Przejść do oczyszczania wirusowego RNA kroku.

Protokół ekstrakcji RNA z wymazów z nosa lub gardła

1. Dodaj 600 µl przygotowanego buforu lizującego zawierającego β-merkaptoetanol i nośnik RNA do wolnej od RNazy probówki mikrowirówki.
2. Delikatnie przetrzyj sterylnym, jednorazowym bawełnianym wacikiem wnętrze nosa lub jamy ustnej pacjenta.
3. Zastosowując sterylne techniki, odetnij bawełnianą końcówkę w miejscu, w którym zebrano komórki nosa lub gardła i umieść ją w probówce mikrowirówki zawierającej bufor lizujący.
4. Zamknąć probówkę.
5. Wirować delikatnie i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
6. Używając pipety, przenieść lizat do innej probówki mikrowirówki wolnej od RNazy.
7. Zanotować objętość lizatu.
8. Dodaj równą objętość 70% etanolu do zebranej objętości lizatu (100 µL etanolu dodaje się do każdych 100 µL lizatu).
9. Wiruj, aby wymieszać.
10. Przejść do oczyszczanie wirusowego RNA krok.

Oczyszczanie wirusowego RNA

1. Nanieść pipetą do 700 µL mieszaniny próbki i etanolu na kolumnę wiążącą i wirować z prędkością 14 000 obrotów na minutę przez 15 sekund.
2. Uważnie odrzuć przepływ i powtórz powyższy krok w razie potrzeby dla całej próbki.
3. Dodaj 500 µL buforu płuczącego 1 do kolumny i wiruj z prędkością 14 000 obrotów na minutę przez 15 sekund.
4. Uważnie przenieś kolumnę do nowej probówki zbiorczej (w zestawie) i oznacz etykietą.
5. Dodaj 500 µL buforu płuczącego 2 do kolumny i wiruj z prędkością 14 000 RPM przez 15 sekund.
6. Ostrożnie odrzuć przepływ i powtórz powyższy krok.
7. Ostrożnie odrzuć przepływ i wiruj z maksymalną prędkością przez 2 minuty, aby osuszyć kolumnę. Śladowe ilości etanolu będą miały negatywny wpływ na dalsze procesy.
8. Przenieś kolumnę do nowej probówki i odpowiednio ją oznakuj.
9. Dodaj 50 µL buforu elucyjnego i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
10. Wiruj z prędkością 14,000 RPM przez 1 minutę.
11. Użyj eluowanego RNA natychmiast lub przechowuj w temperaturze -80 °C.

.

Rysunek 1. Wydajność wirusowego RNA oczyszczonego za pomocą zestawu GenElute™ Mammalian Total RNA Purification Kit. Panel Armored RNA SARS-CoV-2 został seryjnie rozcieńczony w uniwersalnym podłożu transportowym i oczyszczony zgodnie z powyższym protokołem. Wirusowe fragmenty RNA wykryto za pomocą zestawu TaqMan RT-qPCR (Norgen). Krzywe amplifikacji z zestawu starterów/sond N1 (A) i zestawu starterów/sond RNase P (B) zostały określone ilościowo przy użyciu krzywych standardowych w celu określenia wydajności RNA (C i D).