Protokół odczynnika do transfekcji Escort™ III

Nr produktu L3037

Wprowadzenie

Escort III to zawiesina liposomowa składająca się z polikationowego lipidu i neutralnego, nietransfekującego związku lipidowego.Transfekcja przy użyciu liposomów jest powszechnie stosowaną metodą wprowadzania DNA do komórek eukariotycznych. Technika ta została wykorzystana do uzyskania zarówno przejściowej, jak i stabilnej transfekcji w wielu różnych typach komórek (patrz poniżej). Procedura opiera się na tworzeniu kompleksu między plazmidowym DNA a odczynnikiem lipidowym, który przylega do powierzchni komórki i jest pobierany przez komórkę, prawdopodobnie przez endocytozę, uwalniając DNA do cytoplazmy.

Komórki testowane pod kątem dobrej wydajności transfekcji

Linie komórek	Komórki podstawowe
COS HepG2 Jurkat PC-12 NIH3T3	Kardiomiocyty (szczur) Fibroblasty (szczur) Komórki rozrodcze (samiec szczura) Hepatocyty (szczur i chomik) Keratynocyty (człowiek) Mioblasty (przepiórka) Neurony siatkówki (pisklę) Komórki tchawiczo-oskrzelowe (człowiek)

Przechowywanie

2 - 8 °C.  NIE ZAMRAŻAĆ.

Środki ostrożności i zastrzeżenia

Ten produkt jest przeznaczony wyłącznie do użytku badawczo-rozwojowego, a nie do celów farmaceutycznych, domowych lub innych. Prosimy o zapoznanie się z Kartą Charakterystyki w celu uzyskania informacji dotyczących zagrożeń i bezpiecznego obchodzenia się z produktem.

 

Procedura transfekcji adherentnych komórek pierwotnych i linii komórkowych

Poniższy protokół został opracowany z myślą o dobrej wydajności w różnych typach komórek. Aby uzyskać najwyższą wydajność transfekcji, należy użyć protokołu optymalizacji w celu określenia najlepszego zestawu warunków dla komórek.

Dzień pierwszy: Płytkowanie komórek

Płytkuj komórki dzień przed transfekcją.  Użyj gęstości siewu, która zapewni > 70% konfluencji około 12 godzin później, ogólnie zgodnie z poniższą tabelą:

Płytka hodowlana	.Całkowita liczba komórek na płytkę (na dołek)
24-dołkowa płytka	0.5 - 2 x105
12-dołkowa płytka	0.25 - 1 x106
6-dołkowa płytka lub naczynie 3,5 cm	0.5 - 2 x106
Płytka 10 cm	1 - 2 x106

Dzień drugi: Transfekcja

1. Rozcieńczyć DNA i odczynnik lipidowy do kompleksowania zgodnie z poniższą tabelą. Do rozcieńczania używaj tylko nieuzupełnionej pożywki podstawowej. W probówce A rozcieńczyć plazmidowe DNA w pożywce. W probówce B rozcieńczyć odczynnik lipidowy w pożywce.

	Probówka A		Probówka B
Naczynie hodowlane	Objętość DNA (µL)	Objętość medium (µL)	Objętość odczynnika do transfekcji Escort III (µL)	Objętość pożywki (µL)	Przybliżona objętość pożywki podczas transfekcji
24-dołkowa płytka	0.5	9,5	0.5	9.5	500 µL
Płytka 12-dołkowa	1	49	1	49	1 mL
6-dołkowa płytka lub 3.5 cm	2	98	2	98	2 ml
10 cm naczynie	5	495	5	495	5 ml

2. Dodać probówkę A do probówki B i delikatnie wymieszać.  Pozostawić kompleksy na 15-30 minut w temperaturze pokojowej.

3. Usunąć połowę pożywki z każdego naczynia do hodowli komórkowej i wyrzucić.

4. Dodaj kompleksy kroplami do hodowli komórkowych. Delikatnie obracaj płytkami, aby równomiernie rozprowadzić kompleksy na komórkach.

5. Inkubuj komórki przez 5-18 godzin w temperaturze 37°C, a następnie zmień pożywkę (użyj zwykłej pożywki wzrostowej).  Pozwól komórkom kontynuować inkubację przez kolejne 24 - 72 godziny.

Dzień trzeci i kolejne: Analizuj komórki

Zbierz i lizuj komórki - są one gotowe do użycia w innych zastosowaniach. Alternatywnie, można pasażować komórki do innych zastosowań.

Procedura transfekcji komórek Jurkat w hodowli stacjonarnej

Poniższy protokół został opracowany z myślą o dobrej wydajności przy użyciu hodowli zawiesinowej komórek Jurkat umieszczonych w 3.

Dzień pierwszy: Umieszczenie komórek na płytce i transfekcja

1. Umieść komórki na płytce jeden dzień przed transfekcją. Odwirować zawiesinę hodowli Jurkat i przemyć PBS.  Powtórzyć wirowanie i płukanie. Ponownie zawiesić osad w nieuzupełnionej pożywce podstawowej w stężeniu 6 x 10⁶ komórek/ml.  Umieścić 0,8 ml roztworu komórkowego w każdym naczyniu o średnicy 3,5 cm.

2. Rozcieńczyć DNA i odczynnik lipidowy do kompleksowania zgodnie z poniższą tabelą.  Do rozcieńczania używać wyłącznie pożywki bez surowicy lub nieuzupełnionej pożywki podstawowej. W probówce A rozcieńczyć 2 µL plazmidowego DNA w 98 µL pożywki.  W probówce B rozcieńczyć 2 µL odczynnika lipidowego w 98 µL pożywki.

3. Dodać probówkę A do probówki B i delikatnie wymieszać. Pozostawić kompleksy na 15-30 minut w temperaturze pokojowej.

4. Dodać kompleksy kroplami do hodowli komórkowych. Delikatnie wymieszaj płytki, aby równomiernie rozprowadzić kompleksy na komórkach.

5. Inkubuj komórki przez 5-8 godzin w temperaturze 37°C, a następnie zmień pożywkę (użyj zwykłej pożywki wzrostowej). Pozwól komórkom kontynuować inkubację przez kolejne 24 - 72 godziny.

6. Dodaj 4 ml pożywki podstawowej + 12,5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do każdego dołka i inkubuj przez kolejne 72 godziny.

Dzień trzeci i kolejne: Analizuj komórki

Przenieś hodowlę do probówki wirówkowej o pojemności 10 ml i wiruj przy 400 g przez 10 minut. Dwukrotnie przepłucz osad komórkowy w PBS. Komórki są teraz gotowe do użycia w innych zastosowaniach.