ウエスタンブロッティングのための細胞溶解・タンパク質抽出
細胞または組織(新鮮または凍結)からのタンパク質抽出のステップはすべて2~8℃で実施します。タンパク質サンプル調製に用いる一般的な溶解バッファーの組成を以下に示します。
Ready-to- useのタンパク質抽出用RIPAバッファー液(製品番号R0278)
- NaCl (S3014) 150mM
- Triton X-100 (T8787) 1%
- デオキシコール酸ナトリウム (D6750) 0.5%
- SDS (/JP/ja74255) 0.1%
- Tris-HCl (T1503) pH 8.0、50 mM
プロテアーゼ阻害剤 –サンプル調製中にタンパク質が失われないようにします
タンパク質抽出プロトコルのステップ
- 培養細胞入りシャーレの培地を廃棄し、氷冷PBSを用いて細胞を洗浄します。
- PBSを廃棄し、氷冷溶解バッファーを添加します。
- 冷却したプラスチック製セルスクレーパーを用いて細胞をかきとります。マイクロチューブに細胞を集めます。
- マイクロチューブ内の内容物を撹拌します(30分、4℃)
- チューブを遠心分離します(16,000G、20分、4℃)。上清を新しいチューブに集め、氷上に静置します。ペレットを廃棄します。
懸濁液中の細胞からのタンパク質抽出
- 細胞懸濁液を遠心分離します(2,000G、5~7分、4℃)。細胞をチューブ底部に集め、上清を廃棄します。
- 細胞ペレットに氷冷PBSを添加し、遠心分離(2,000G、5~7分、4℃)により細胞を洗浄します。
- 氷冷溶解バッファーを細胞ペレットに添加します。マイクロチューブ内の内容物を撹拌します(30分、4℃)。
- チューブを遠心分離します(16,000G、20分、4℃)。上清を新しいチューブに集め、氷上に静置します。ペレットを廃棄します。
組織からのタンパク質抽出
- 対象組織を氷上で切り出します。組織を丸底マイクロチューブに移し、液体窒素に浸漬することにより瞬間凍結させます。
- 組織5 mgに対し、氷冷溶解バッファー300 µLを添加し、電動ホモジナイザーを用いてホモジナイズします。ホモジナイズ中に溶解バッファー300~600 µLを添加します。
- 内容物を撹拌します(2時間、4℃)
- チューブを遠心分離します(16,000G、20分、4℃)。上清を新しいチューブに集め、氷上に静置します。ペレットを廃棄します。
サンプル全体の総タンパク質濃度を統一
- 小容量のライセートを採取しタンパク質定量アッセイを実施します。
- タンパク質定量は、クマシータンパク質アッセイ試薬(製品番号27813)、BCAアッセイ、280 nm吸光度を用いることにより実施されます。
- 標準物質との比較により未知のサンプルのタンパク質濃度を測定し、標準物質が未知のサンプルと同一のバッファーで希釈されていることを確認します。
- すべてのサンプルが等濃度のタンパク質を含有するよう、適切な容量のライセートをマイクロチューブに移します。
- すべてのライセートが等容量になるよう、適切に氷冷溶解バッファーを添加します。
サンプルをLaemmliローディングバッファーと混和します。
電気泳動用サンプルの調製に必要なローディングバッファーの組成は以下のとおりです。
2X Laemmliローディングバッファー
ブロモフェノールブルー(製品番号B5525)0.004%
2-メルカプトエタノール10%
グリセロール(製品番号G5516)20%
SDS(製品番号/JP/ja74255)4%
Tris-HCl(製品番号T1503)0.125 M
- 細胞ライセートに、等量のローディングバッファーを添加します。
- 上記混合物を煮沸します(95℃、5分)。16,000Gで5分、遠心分離します。
- これらのサンプルは、-20℃で保存することが可能であり、ゲル電気泳動に使用することもあります。
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