Prestige Antigens™—ブロッキングプロトコル

抗原ブロッキングプロトコル

Prestige Antigens™および対応するPrestige抗体は、以下に示す標準のブロッキングプロトコルに従って使用することが推奨されます。

IHCまたはICC実験の事前吸着に用いるPrestige Antigens™

抗体を再滴定して、ブロッキング試験への使用に最適な希釈倍率を決定します。最適な滴定は、期待される染色を抗体が示すことのできる最大限の希釈倍率のことです。

抗体（150,000 Da）およびPrestige抗原（15,000 Da）の濃度およびMWに基づいて、Prestige抗原の10倍および100倍のモル過剰量を計算します。

それぞれの計算量の抗体とPrestige抗原を2 mLチューブに入れて混合し、PBSを用いて総容量を30～50 μLに調節します。

抗体／Prestige抗原の入ったチューブを室温で30分間、または4℃でゆっくり振盪しながら一晩インキュベートします。

コントロールにはPrestige抗原を含まない一次抗体を用いるか、または別の（ターゲットタンパク質に該当しない）Prestige抗原を使用します。

抗体／Prestige抗原の入ったチューブを最大速度（15,000 rpm）で15分間遠心分離し、免疫複合体のすべてを沈殿させます。

上清を新しいチューブへピペットで慎重に移し、免疫染色用の作業溶液を調製します。抗体はこの時点で4～12倍に希釈されているため、それに応じて抗体希釈液の容量を調節する必要があります。

一般的なIHCまたはICCのプロトコルに従って実験を進めます。

WB実験の事前吸着に用いるPrestige Antigens™

該当するPrestige抗原（100倍モル過剰）とともに、1:250に希釈した一次抗体を3.5 mLブロッキングバッファーに入れて、室温で30分間プレインキュベートします。Prestige抗原の100倍モル過剰は、抗体（150,000 Da）およびPrestige抗原（15,000 Da）の濃度およびMWに基づいて計算されます。

ウェスタンブロッティングのコントロールにはPrestige抗原を含まない一次抗体反応を行うか、または抗体ターゲットに該当しない別のPrestige抗原を使用します。

インキュベートした抗体とPrestige抗原混合液をブロッキング済みのメンブレンに添加し、ローラーミキサーまたはロッキングシェーカーに載せて室温で1時間インキュベートします。

一般的なウェスタンブロッティングのプロトコルに従ってウェスタンブロッティングを進めます。

2017年10月更新