免疫組織染色

IHC用の組織の調製・抗原賦活化・前処理

一般に組織は固定し、パラフィンに包埋して、IHC分析用にミクロトームを用いて切片化します。最初の組織調製後に続く重要な工程は抗原賦活化です。固定中に形成されたタンパク質の架橋を切断し、隠れていた抗原部位を露出させる必要があります。抗原エピトープへの接近性は多くの生物学的要因によって大きく変動する可能性があるので、抗原賦活化および前処理の条件は経験的に決定しなければなりません。例えば、抗体と結合するエピトープを「露出」させるため、中にはより攻撃的な前処理が必要となる抗原もありますし、全く前処理が不要な抗原もあります。広く使用されている2つの抗原賦活化前処理法のうち、1つは緩衝液および酵素（プロテイナーゼK）との結合で熱源を使用する加熱抗原賦活化（HIER）法です。2つめは、タンパク質分解抗原賦活化（PIER）法で、プロテイナーゼK、トリプシン、キモトリプシンまたはペプシンなどの各種プロテアーゼを用いる方法です。

IHCの染色・検出

組織の準備および抗原賦活化前処理後、抗体と抗原の相互作用を視覚化するにはさまざまな方法があります。一般的な方法としては、呈色反応を触媒する西洋ワサビペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼなどの酵素と結合させた一次抗体を使用します。免疫蛍光染色（IF）法ではフルオレセイン、ローダミンまたはAlexa Fluorなどの蛍光色素を標識した抗体を使用します。また、非標識一次抗体を使用し標識二次抗体で間接的に抗原を検出する、またはより複雑な検出システムを使用する方法もあります。この場合は、一次抗体と二次抗体の両方の最適力価をアッセイごとに測定する必要があります。