二次抗体・標識・キット

二次抗体

二次抗体は、一次抗体、あるいはFcまたはFab領域などの一次抗体フラグメントに結合するポリクローナルまたはモノクローナル抗体です。これらは通常プローブで標識されており、検出、精製、またはソーティングのアプリケーションに使用します。私たちのポリクローナル二次抗体は、ウサギ、ヤギ、およびヒツジなどの宿主動物の血清から産生されており、モノクローナル二次抗体は、主としてマウスのハイブリドーマクローンから産生されます。二次抗体は、ELISA、免疫精製、ウェスタンブロッティング、IHC、IF、フローサイトメトリーなどの、数多くのアプリケーションに使用されます。 

二次抗体に固有の用途は、結合しているプローブに依存します。プローブは、各種検出技術をサポートする分子です。最も一般的な複合二次抗体の検出システムは、比色法または蛍光法です。比色法は、アルカリホスファターゼ（AP）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）、またはその派生物に基づくものが一般的です。ビオチン／アビジン（ストレプトアビジン）複合体結合システムは、APやHRPの比色シグナルを増幅するために良く使用されます。最も一般的な蛍光法は、フルオレセイン（FITC）、ローダミンやその派生物、TRITC、Cyanine（Cy3）、フィコエリスリン（R-PE）、CF™またはAttoなどの色素を用います。

私たちは、さまざまな二次抗体を提供しています。

抗体の特異性

二次抗体は、種々の動物種のイムノグロブリンに対して生成され、抗原に結合した一次抗体をイムノアッセイで可視化するための試薬です。全分子またはFabに特異的なIgGに対する抗体は、ほとんどの場合にすべてのIgクラスと反応しますが、重鎖およびFcに特異的な抗体は、目的のIgクラスのみと反応します。研究者の皆様は、取り組んでいる研究にはどのような特異性が最適かを見定める必要があります。試薬の選択は測定系に依存するとともに、抗体と結合して偽陽性の結果や高いバックグラウンドを引き起こすおそれのある外来タンパク質標的が存在するかどうかにも影響を受けます。表Aに、各種タイプの二次抗体とその用途の概要を示します。

表A 抗体の特異性

抗体の特異性	説明	用途
抗IgG（全分子）	抗IgG（全分子）抗体は、インタクトなIgG分子を免疫原として使用して生成されてきました。宿主自身のIgGとは異なるすべてのIgG分子の部分を対象として、抗体が開発されています。認識されたエピトープの一部が、別の動物種のIgで見つかることもあります。これは、IgG（全分子）に対する抗体が、非常に広範囲の特異性を持ち、IgAやIgMなどの別のIgクラスだけでなく、別の動物種由来のIgGとも交差反応する可能性があることを意味します。例えば抗ヤギIgG（全分子）は、ヒトIgGと反応する可能性があります。	複数のIgクラスが存在することが問題とならない場合、存在するすべてのIgを検出したい場合、サブクラスに依存しない場合、または強いシグナルが必要な場合に使用します。また、抗体のIgクラスがわからない場合や、細胞または組織サンプル中の全Igを検出する場合にも適しています。
抗IgG（Fab特異的）	Fab特異的抗体は、IgGのパパイン分解によって産生されたFabフラグメントを、宿主動物に免疫することにより生成されます。FabフラグメントはすべてのIgクラスに共通するエピトープを持つため、これらの抗体はすべてのIgクラスを認識できます。これらは、クラス特異的なFc領域には結合しません。これらの抗体は、抗IgG（全分子）と同じように、動物種間で共有されるエピトープを介して別の動物種由来のIgと反応できます。	Fc領域との結合ができないか、または望ましくない場合、例えばプロテインA、抗Fc特異的抗体、または細胞表面のFc受容体によって標的Ig Fcを結合する場合などに使用します。
抗IgG（重鎖特異的）（α、γ、μ）	重鎖特異的抗体は、交差反応性をほぼすべて除去するために免疫原のIgクラスとは限らないIg分子上のエピトープに吸収させた、抗全分子抗体から調製されます。吸収処理は、免疫原と動物種は同じだがIgクラスが異なるイムノグロブリンを含有する吸収剤を用いて、後述する各種動物種による抗IgG（吸収処理済み）の説明に従って行われます。吸収剤Ig上でエピトープを認識した抗体は吸収剤と結合し、重鎖特異的抗体は非結合部分に回収されます。その結果、この抗体は1つのIgクラスのみを認識します。この特異性は、重鎖のFc領域にあるクラス特異性決定因子に相当するギリシャ文字により、α鎖（IgA特異的）、γ鎖（IgG特異的）、μ鎖（IgM特異的）のように示されます。	標的に複数のIgクラスがあっても、目的のクラスが1つのみの場合に使用します。一般的には、組織切片や細胞サンプルを用いたフローサイトメトリーで、重鎖特異的な抗IgG、IgA、またはIgMを蛍光色素と結合させて個々のIgを検出し、特定の細胞タイプにおける個々のIgのレベルを測定するために使用されます。また、二重標識にも有用です。例えば、IgGモノクローナル抗体とIgMモノクローナル抗体を使用して、抗マウスIgG（γ鎖特異的）および抗マウスIgM（μ鎖特異的）と結合した抗体を異なる蛍光色素標識で検出することにより、1つの組織切片で2つの異なる抗原が特定されます。
抗IgG（Fc特異的）	Fc特異的抗体は、IgGのパパイン分解によって産生されたFcフラグメントを、宿主動物に免疫することにより生成されます（抗体の断片化のセクションを参照）。この抗体はIgGに対して非常に特異的で、IgAやIgMを認識しません。注記：Fc特異的およびγ鎖特異的抗体は、本質的に同じ特異性を持ちます。	抗Ig（重鎖特異的）と同じですが、IgGにのみ使用します。
抗IgG（吸収処理済み）	この抗体は、標的IgGの動物種とは異なる動物種由来のIgGと吸収することにより、これらの動物種との交差反応性を除去されます。この交差反応性は、複数の動物種に共通するエピトープがイムノグロブリンに含まれることによって生じます。吸収処理は、固相担体（吸収剤）に付着した別の動物種由来のIgGによって抗体をインキュベートすることで行われます。これらの動物種由来のIgG上でエピトープを認識した抗体は吸収剤と結合し、動物種特異的抗体は非結合部分に回収されます。その結果、この抗体は標的動物種由来のIgGとの良好な反応性は維持しますが、吸収剤の動物種との反応性は最小化されます。吸収処理済み二次抗体は、一次抗体に加えて分析対象のタンパク質や組織へ二次抗体が結合することによって生じるイムノアッセイのバックグラウンドを抑えるために有効です。	別の動物種由来の潜在的標的が含まれるマトリックスに標的IgGを付着させる場合に使用します。例えば、ヒトの細胞や組織の一次抗体をイムノアッセイで検出する場合は、ヒト血清タンパク質で吸収処理した二次抗体を選択してください。

標識

アルカリホスファターゼ標識

アルカリホスファターゼ（AP）は、アルコール、フェノール、およびアミンをアルカリ性pHで脱リン酸化する腸内酵素で、140 kDaのホモ二量体です。活性に最適なpHの範囲は9.5～10.5です。

アルカリホスファターゼ標識は、ELISA、^2,3免疫組織染色法、免疫細胞染色法⁴およびイムノブロット⁵などのイムノアッセイに広く使用されています。AP標識は、内因性ペルオキシダーゼ活性が原因で、ペルオキシダーゼ標識による高いバックグラウンド染色が生じるおそれのある組織に有効です。一般に、AP標識はペルオキシダーゼ標識より高感度なため、ELISAやブロッティングアッセイでの高い希釈率の使用や低レベルシグナルの検出を可能にします。組織切片での内因性アルカリホスファターゼ活性は、レバミゾール（L9756）を基質バッファーに添加することによりブロックされます。⁶ レバミゾールは、腸内アルカリホスファターゼ以外のすべてのアルカリホスファターゼアイソザイムを阻害します。

アルカリホスファターゼ基質は、可溶性生成物または非可溶性生成物のタイプが用意されています。

アルカリホスファターゼ標識の腸組織の切片や抽出物への使用は、腸内で内因性のアルカリホスファターゼ活性が生じるため推奨されません。

図1.抗ヒトIgG（γ鎖特異的）－アルカリホスファターゼ標識ヤギ宿主F(ab)2フラグメント抗体（製品番号A3312）で染色したヒト扁桃腺のホルマリン固定パラフィン包埋切片。基質としてSIGMA FAST™ Fast Red TR／ナフトールAS-MX錠（製品番号F4523）を使用した。

参考文献

1. O'Sullivan M, Gnemmi E, Morris D, Chieregatti G, Simmons M, Simmonds A, Bridges J, Marks V. 1978. A simple method for the preparation of enzyme-antibody conjugates. 95(2):311-313. https://doi.org/10.1016/0014-5793(78)81018-7

2. LUNDBERG BB, GRIFFITHS G, HANSEN HJ. 1999. Conjugation of an Anti-B-cell Lymphoma Monoclonal Antibody, LL2, to Long-circulating Drug-carrier Lipid Emulsions. 51(10):1099-1105. https://doi.org/10.1211/0022357991776787

3. Pretorius A. 1997. The binding potential of commercial antibody conjugates with sera of various small terrestrial mammals. Onderstepoort J. Vet.Res..(64):201-203.

4. Heider H, Schroeder C. 1997. Focus luminescence assay: macroscopically visualized foci of human cytomegalovirus and varicella zoster virus infection. Journal of Virological Methods. 66(2):311-316. https://doi.org/10.1016/s0166-0934(97)00063-3

5. Roe IH, Son SH, Oh HT, Choi J, Shin JH, Lee JH, Hah YC. Changes in the Evolution of the Antigenic Profiles and Morphology during Coccoid Conversion of Helicobacter pylori. Korean J Intern Med. 14(1):9-14. https://doi.org/10.3904/kjim.1999.14.1.9

6. Beesley J. 1993. Immunochemistry: A Practical Approach. Oxford, England: IRL Press.

ペルオキシダーゼ標識

ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）は、プロトン供与体の存在下で過酸化水素を特異的に減少させる酵素で、40 kDaの糖タンパク質です。活性に最適なpHの範囲は6.0～6.5です。HRPは、優れた熱安定性（最大60℃）とpH安定性（4～10）を示し、アジ化ナトリウムによって阻害されます。

ペルオキシダーゼ標識は、ELISA^4,5、免疫組織染色法と免疫細胞染色法⁶およびイムノブロット⁷などの広範囲のイムノアッセイに使用されています。 HRP標識は、内因性アルカリホスファターゼ活性が原因で、アルカリホスファターゼ標識では高いバックグラウンドが生じるおそれのある腸などの組織に有効です。アルカリホスファターゼに比べて、ペルオキシダーゼ基質は選択肢が多く、発色強度も多くの場合に優れています。内因性ペルオキシダーゼ活性は、標識を添加する前に過剰な過酸化水素で組織を処理するか、またはフェニルヒドラジン、アジ化ナトリウム+過酸化水素、または過ヨウ素酸などの他のブロッキング剤を使用することによりブロックされます。⁸ さまざまな基質が、可溶性生成物または非可溶性生成物のタイプで用意されています。

内因性ペルオキシダーゼ活性が高レベルになっている血液細胞や尿細管のサンプルへのHRP標識の使用は推奨されません。

参考文献

1. Avrameas S. 1978. Scand.J. Immunol., 8, Suppl. 7, 7.

2. Wilson M, Nakane P. 1978. Immunofluorescence and Related Staining Techniques. Elsevier/North Holland Biomedical Press.215.

3. O'Sullivan M, Gnemmi E, Morris D, Chieregatti G, Simmons M, Simmonds A, Bridges J, Marks V. 1978. A simple method for the preparation of enzyme-antibody conjugates. 95(2):311-313. https://doi.org/10.1016/0014-5793(78)81018-7

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5. Piza ASdT, Santos JLF, CHAVES LB, Zanettai CR. 1999. An elisa suitable for the detection of rabies virus antibodies in serum samples from human vaccinated with either cell-culture vaccine or suckling-mouse-brain vaccine. Rev. Inst.Med. trop.S. Paulo. 41(1):39-43. https://doi.org/10.1590/s0036-46651999000100008

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7. Krajewski S, Zapata JM, Reed JC. 1996. Detection of Multiple Antigens on Western Blots. Analytical Biochemistry. 236(2):221-228. https://doi.org/10.1006/abio.1996.0160

8. Beesley J. 1993. Immunochemistry: A Practical Approach. Oxford, England: IRL Press.

蛍光色素標識

蛍光色素分子は1波長（吸収波長または励起波長）の光を吸収し、電子の励起状態を誘発します。この状態は不安定で、分子は発光することによってすぐに非励起状態または基底状態に戻ります。エネルギー損失のために、この発光は波長が長く（エネルギーが低く）なっており、この波長を発光波長と呼びます。励起波長と発光波長の差は各蛍光色素分子に固有で、励起と発光の強度は、最大波長から離れると急速に低下します。蛍光色素一覧表によって、いくつかの一般的な蛍光色素分子の励起波長と発光波長、および蛍光色を確認できます。

表2 蛍光色素一覧表

蛍光色素	励起（nM）	発光（nM）	色	アプリケーション
アクリジンオレンジ	500	526（DNA） 650（RNA）	緑（DNA） 赤（RNA）	核酸染色、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡
Cy3	552	568～574	赤～オレンジ	タンパク質結合、フローサイトメトリー
Cy5	649	670	赤	タンパク質結合、蛍光顕微鏡
DAPI	360	450	青	AT、マイナーグルーブdsDNA染色、 フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡
Dil-C18-(3)	550	565	赤～オレンジ	メンブレン染色（ER、CM）－細胞融合／透過処理、フローサイトメトリー
エチジウムブロマイド	493	620	赤	核酸染色、ゲル電気泳動
フルオレセイン（FITC）	495	525	緑	タンパク質結合、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡
緑色蛍光タンパク質（GFP）	395（470）	509	緑	融合タンパク質、遺伝子組換えタンパク質発現、蛍光顕微鏡
Hoeschst 33258	360	470	青	AT、マイナーグルーブdsDNA染色、 フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡
R-フィコエリトリン（PE）	488	578	赤～オレンジ	タンパク質結合、フローサイトメトリー
PKH2	490	504	緑	細胞膜染色－細胞追跡、 フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡
PKH26	551	567	赤～オレンジ	細胞膜染色－細胞追跡、 フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡
PKH67	490	502	緑	細胞膜染色－細胞追跡、 フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡
CellVue® Claret	655	675	遠赤色	細胞膜染色－細胞追跡、 フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡
ヨウ化プロピジウム	493	632	赤	核酸染色、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡
Quantum Red™	488	670	赤	タンパク質結合、タンデム色素、 フローサイトメトリー
ローダミン（TRITC）	552	570	赤～オレンジ	タンパク質結合、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡
テキサスレッド	596	620	赤	タンパク質結合、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡

蛍光色素は、さまざまな生物学的アプリケーションで分子を検出するために使用されます。¹ 蛍光色素は、他の多くの可視色素とは異なり、ほとんどの場合に生理的条件下での使用が可能で、生きている細胞や組織を染色できます。² 多くの蛍光色素分子があり、それぞれの発光波長は相互に重なることが比較的少ないため、1サンプルを2種類以上の蛍光プローブで染色することができます。^2,3 しかし、そのためには、非常に似通った励起波長と、相当に差がある発光波長が必要になります。Quantum Red™色素などのタンデム色素は、一方の色素の発光波長がもう一方の色素の励起波長と一致する2種類の色素の複合体で、同じランプを使用して別の色を発することができます。細胞骨格を直接染色できるアクリジンオレンジ、DAPI、およびHoechst 33258などの蛍光色素もあり、核酸染色にも使用されます。抗体、レクチン、ヌクレオチドなどの生物学的プローブと結合するフルオレセイン、ローダミン、およびフィコエリトリンなどのその他の色素は、特定の細胞または組織の検出に使用されます。

蛍光色素は、保存および使用中に遮光する必要があります。

参考文献

1. Lausch R, Reif O, Riechel P, Scheper T. 1995. Analysis of immunoglobulin G using a capillary electrophoretic affinity assay with protein A and laser-induced fluorescence detection. Electrophoresis. 16(1):636-641. https://doi.org/10.1002/elps.11501601102

2. Lloyd-Evans, Guest, Austin, Scott. 1999. Use of a phycoerythrin-conjugated anti-glycophorin A monoclonal antibody as a double label to improve the accuracy of FMH quantification by flow cytometry. Transfus Med. 9(2):155-160. https://doi.org/10.1046/j.1365-3148.1999.00187.x

3. Stewart C, Stewart S. 1999. Four color compensation. Cytometry. 38161-175.

CF™色素

CF™色素は、非常に水溶性の高い蛍光色素シリーズで、可視から近赤外（近IR）までのスペクトルをカバーして、抗体、タンパク質、核酸などの生体分子を標識します。画期的な化学技術を用いて開発されたCF™色素の輝度、光安定性、および色選択性は、合理的な色素設計により、他の市販色素と同等以上の品質を実現しています。

CF™色素製品ラインには、反応性CF™色素、標識キット、CF™標識二次抗体、およびその他の生物学的複合体が含まれます。この製品群により二次抗体と標識の広範囲で緻密な選択肢がさらに広がるため、研究者の皆様はさらに高い感度、高輝度の結果、および優れた光安定性をイムノアッセイで獲得できます。

CF™色素に関する詳細情報と蛍光色素比較チャートについては、sigma-aldrich.com/cfdyesをご覧ください。

ビオチン標識

ビオチン（ビタミンH）は、アビジンと4：1の割合で高親和性の結合（K_a = 10¹⁵）をする補助因子です。この結合力は、実質的に不可逆な相互作用をもたらします。この相互作用は、抗原の免疫標識のために組織染色、ブロッティング、およびマルチウェルのアッセイで利用されています。ビオチン標識抗体プローブは、組織サンプル、マイクロタイタープレート、またはメンブレン上の標的と結合します。酵素¹、蛍光色素²またはコロイド金属³と結合したアビジンは、ビオチン標識プローブの複数の部位と結合します。このようにしてアビジンはシグナルを増幅し、結果として抗体－酵素または抗体－蛍光色素の複合体単独よりも高い感度をもたらします。可視化は、 蛍光の検出、酵素によって基質変換した比色法または化学発光法の最終生成物、または顕微鏡観察によって行うことができます。アビジン－ビオチン系は、免疫組織染色法と免疫細胞染色法⁴、イムノブロット⁵およびELISA⁶で使用されてきました。 内因性ビオチンを含む肝臓や腎臓などの一部の組織にアビジン－ビオチン系を使用すると、バックグラウンド染色が高くなるおそれがあります。⁸

図2ヤギ抗マウスIgM-ビオチン標識（製品番号B9265）を使用してB細胞を染色したマウス脾臓の凍結切片。ExtrAvidin^®-ペルオキシダーゼ（製品番号E2886）、DABおよび塩化ニッケルを用いて可視化後、メチルグリーンで対比染色した。100倍で胚中心形成を観察した。 [From W. Lee, Finch University of Health Science, Chicago Medical School, Department of Microbiology and Immunology, N. Chicago, IL.]

参考文献

1. Long Huw Le, Ya Hwei Wang, Jui Huang Shien. 1994. Comparison of the labeled avidin-biotin and the coventional enzyme-linked immunosorbent assay for detecting antibody to reovirus in chickens. Journal of Virological Methods. 48(2-3):343-347. https://doi.org/10.1016/0166-0934(94)90133-3

2. Dale G. 1998. Rapid production of quasi-stable antibody-phycoerythrin conjugates for use in flow cytometry.. Cytometry. 33482-486.

3. Wang JJ. 1989. Immunocytochemical demonstration of the binding of growth-related polypeptide hormones on chick embryonic tissues. Histochemistry. 93(2):133-141. https://doi.org/10.1007/bf00315966

4. Erdamar, et. al. S. 1999. Levels of expression of p27KIP1 protein in human prostate and prostate cancer: an immunohistochemical analysis. Mod.Pathol.. 12751-755.

5. Söderberg A, Sahaf B, Holmgren A, Rosén A. 1998. Monoclonal Antibodies to Human Thioredoxin Reductase. Biochemical and Biophysical Research Communications. 249(1):86-89. https://doi.org/10.1006/bbrc.1998.9053

6. Payette PJ, Cormier M, Dabek B, Yungblut P, Presseault S, Climie S, Sahai J, Cameron WD, Filion LG. 1997. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay for measurement of serum-associated ALX40-4C.. 4(6):671-675. https://doi.org/10.1128/cdli.4.6.671-675.1997

7. Bayer EA, Skutelsky E, Wilchek M. 1979. [55] The avidin-biotin complex in affinity cytochemistry.308-315. https://doi.org/10.1016/0076-6879(79)62235-8

8. Beesley J. 1993. Immunochemistry: A Practical Approach. Oxford, England: IRL Press.

アビジン、ExtrAvidin^®、ストレプトアビジン試薬

アビジンは、メンブレンや組織に対して非特異的結合を示すと報告されています。また、アビジンの非特異的結合が問題となるアプリケーション用にストレプトアビジンとExtrAvidin^®を取り揃えています。

アビジン、ExtrAvidin^®およびストレプトアビジンは、非標識、またはイムノアッセイ用に酵素、蛍光色素、および金コロイドの標識済み製品を取り揃えています。アビジンは、アガロースに固定されているタイプもあり、免疫沈降法やアフィニティ精製の処理に使用されます。

アビジン
アビジンは卵白に見られる65 kDaのタンパク質で、4つの同一サブユニットから成り、それぞれがビオチン（ビタミンH）に対する高親和性結合部位を持ちます。この結合力（K_a = 10¹⁵）は、実質的に不可逆な相互作用をもたらします。この相互作用は、抗原の免疫標識のために組織染色、ブロッティング、およびマルチウェルのアッセイで利用されてきました。ビオチン標識プローブは、二次抗体やレクチン、そのほかの生理活性物質で、組織サンプル、マイクロタイタープレート、またはメンブレン上のターゲットと結合します。酵素や蛍光色素などの標識と結合したアビジンは、基質の蛍光検出や酵素変換を検出することによりビオチン標識プローブと結合し、目に見える最終生成物を産生して可視化します。このシステムではアビジンは二次プローブとして機能し、一次ビオチン標識プローブの複数の部位に付着してシグナルを増幅します。アビジン－酵素複合体を使用すれば、酵素による基質変換によってさらに増幅され、基質が枯渇するか反応が停止されるまで、目に見える生成物を産生し続けます。

ExtrAvidin^®
ExtrAvidin^®は、卵白アビジンの修飾型で、アビジンのビオチンに対する高い親和性と特異性を維持しますが、アビジンで報告されているような生理的pHにおける非特異的結合を示しません。

ストレプトアビジン
ストレプトアビジンは、Streptomyces avidiniiによって産生されるアビジンの一種で、卵白アビジンより若干低い非特異的結合を示しますが、バックグラウンド染色が問題になることがあります。ストレプトアビジンは、約60 kDaのホモ四量体タンパク質で、それぞれが約15 kDaの4つの同一サブユニットから成ります。1分子のストレプトアビジンは、実質的に不可逆な非共有相互作用によって4分子のビオチンと結合します。

ExtrAvidin^®染色キット

カタログでのみ入手可能なExtrAvidin^®は特殊な形態のアビジンで、アビジンのビオチンに対する高い特異性および親和性と、生理的pHにおける低い非特異的結合を両立します。そのため、ExtrAvidin^®アルカリホスファターゼおよびペルオキシダーゼ複合体は、低バックグラウンドで高感度を示します。

特長・利点

• 免疫組織染色法^1,2、ELISA^3,4およびイムノブロットアッセイ^5,6に使用
• EXTRA-2およびEXTRA-3のアフィニティ精製抗体はヒトIgGおよびIgMで吸収処理済みで交差反応性を最小化
• ビオチン標識抗体はスペーサを備え、ExtrAvidin^®複合体へのアクセスを改善

参考文献

1. Navarro A, Tolivia J, Astudillo A, del Valle E. 1998. Pattern of apolipoprotein D immunoreactivity in human brain. Neuroscience Letters. 254(1):17-20. https://doi.org/10.1016/s0304-3940(98)00639-9

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