Nucleasi (DNasi e RNasi)

Endonucleasi di restrizione

Nucleasi per la digestione di DNA e RNA

Le nostre nucleasi variano per specificità di sito di taglio e per proprietà come il pH ottimale. Il ricercatore può scegliere l’enzima di digestione più adatto alle proprie esigenze sperimentali. La desossiribonucleasi I da mammifero, ad esempio, fornisce prodotti con terminale 5’, mentre la nucleasi P1 da Penicillium citrinum degrada l’RNA e il DNA a singolo filamento, ma non il DNA a doppio filamento. La ribonucleasi A idrolizza l’RNA che potrebbe contaminare i campioni di proteine o le preparazioni di DNA plasmidico. Molti di questi enzimi trovano ulteriori impieghi in biologia molecolare. Ad esempio, la DNasi I produce rotture a singolo filamento nel DNA (nick) che consentono l’incorporazione di basi marcate. La RNasi A è uno strumento utilizzato nel saggio di protezione dalla RNasi per misurare l’abbondanza di mRNA specifici.

DNasi: desossiribonucleasi I e desossiribonucleasi II

La desossiribonucleasi I catalizza la scissione endonucleolitica del DNA a sia a doppio che a singolo filamento. Il prodotto dell’idrolisi è una miscela complessa di mononucleotidi e oligonucleotidi 5'-fosfato. In presenza di ioni magnesio, la DNasi I taglia indipendentemente l’uno o l’altro dei due filamenti del DNA con siti di taglio casuali. In presenza di manganese (II), la DNasi I scinde entrambi i filamenti di DNA approssimativamente nello stesso punto. La maggior parte dei protocolli utilizza ioni magnesio, ma per scopi specifici si usa il manganese. La desossiribonucleasi II catalizza la scissione endonucleolitica del DNA sia a doppio che a singolo filamento con produzione di nucleosidi 3'-fosfato e oligonucleotidi 3’-fosfato. Il range di pH per l’attività è compreso tra 4,0 e 6,5, con solo il 15% di attività a pH 6,5. Il pH ottimale è 5,0. La stabilità ottimale dell’enzima si ottiene a un pH compreso tra 5 e 5,5, con una rapida inattivazione a pH 8,5 a 30 °C. Offriamo un ampio assortimento di DNasi per l’uso con di svariati tipi di campioni e applicazioni. La concentrazione delle RNasi o proteasi presenti in alcune delle nostre DNasi, sia in forma liofilizzata che liquida, è significativamente bassa, per evitare il rischio di digestione indesiderata.

RNasi: Ribonucleasi A, Ribonucleasi H e Ribonucleasi T₁

La ribonucleasi A catalizza la scissione endonucleolitica dell’RNA per produrre nucleosidi 3'-fosfato e oligonucleotidi 3'-fosfato con terminazione in Cp o Up. Gli attivatori della RNasi A includono i sali di potassio e di sodio. La temperatura ottimale per l’attività corrisponde a 60 °C, anche se l’enzima mostra attività già a partire da 15 °C e fino a 70 °C. Il pH ottimale è 7,6, con un range di attività di 6-10. L’attività massima si osserva con l’RNA a singolo filamento. L’RNasi A è un enzima molto stabile e può sopportare temperature fino a 100 °C. A 100 °C, la RNasi A è più stabile a un pH compreso tra 2,0 e 4,5. La ribonucleasi H idrolizza specificamente i legami fosfodiesterici dell’RNA nei duplex RNA:DNA per generare prodotti con terminazione 3'-ossidrile e 5'-fosfato. Degrada solo l’RNA degli ibridi DNA-RNA (RNA legato a un filamento di DNA complementare tramite legami idrogeno).

La ribonucleasi T₁ catalizza la scissione endonucleolitica in due fasi dell’RNA con produzione di nucleosidi 3'-fosfato e oligonucleotidi 3'-fosfato prevalentemente con terminazione in Gp. Nella reazione, la scissione avviene tra il gruppo 3'-fosfato di un ribonucleotide guanidina e il gruppo 5'-ossidrile del nucleotide adiacente. Il prodotto iniziale è un nucleoside 2':3' fosfato ciclico che viene idrolizzato al nucleoside 3'-fosfato corrispondente. In soluzione, è resistente al calore (100 °C per 10 minuti a pH 6) e all’acido, ma è instabile in soluzione alcalina (>pH 9). Si ricorda che la reazione catalizzata dall’enzima non può essere interrotta riscaldando la miscela di reazione a 100 °C. Offriamo un ampio assortimento di RNasi per l’uso con diversi tipi di campioni e applicazioni. La concentrazione delle proteasi presenti in alcune delle nostre RNasi, sia in forma liofilizzata che liquida, è significativamente bassa, per evitare il rischio di degradazione delle proteine del campione.