Purificazione delle proteine

Fattori critici per la purificazione delle proteine

La struttura e la funzione delle proteine sono spesso tra i fattori critici da considerare nella scelta della strategia di purificazione. L'attività biochimica o biologica di una proteina ricombinante è parzialmente determinata da domini discreti all'interno della proteina stessa, che dipendono, in buona parte, dal ripiegamento della proteina nelle sue strutture secondaria, terziaria e quaternaria.

Il ripiegamento delle proteine, che viene complessivamente definito struttura di ordine superiore (HOS), è essenziale per la corretta forma tridimensionale e per la funzione della proteina. Un’altra caratteristica molto importante per la purificazione di una proteina è data dalla sua solubilità che è influenzata da numerosi fattori tra cui la dimensione e gli elementi presenti in corrispondenza dell’N e del C-terminale. Comunemente, le proteine ricombinanti incorporano in posizione N- e C-terminale delle etichette (tag), cioè piccole sequenze utilizzate per il rilevamento e la purificazione mediante immunoistochimica o cromatografia di affinità, a seconda del tipo di etichetta e della successiva applicazione.

Metodiche di purificazione delle proteine e relative applicazioni

I ricercatori hanno oggi a disposizione numerose metodiche, reagenti e strumenti per la purificazione delle proteine, sia che intendano studiarne la funzione o che cerchino di incrementarne la purificazione usando strategie su scala industriale per produzioni biologiche e farmaceutiche La metodica di purificazione prescelta determinerà in parte il flusso di lavoro per la preparazione del campione. La cromatografia di affinità rappresenta una fase di purificazione iniziale adatta per le proteine​ricombinanti solubilizzate che contengano le tag opportune; spesso succede però che si leghino alla colonna anche proteine indesiderate e che eluiscano nel lavaggio finale insieme alla proteina di interesse. Se è necessario si ricorre quindi ad un ulteriore fase di purificazione utilizzando strategie di purificazione supplementari che includono la cromatografia di esclusione dimensionale o la cromatografia a scambio ionico. È importante sottolineare che, nel caso in cui i ricercatori vogliano eliminare qualsiasi sequenza non nativa dalla proteina purificata finale, molte delle etichette di affinità possono essere rimosse.