Elettroforesi su gel

SDS-PAGE

L’SDS-PAGE (elettroforesi su gel di poliacrilammide in presenza di sodio dodecilsolfato) consente la separazione delle proteine​in base al loro peso molecolare. In questa metodica, il detergente SDS viene aggiunto al tampone di corsa. L’SDS conferisce una carica netta negativa alle proteine, mascherando la loro carica intrinseca. Inoltre, la presenza di SDS e reagenti denaturanti, fa si che le proteine perdano la loro struttura nativa e siano presenti come catena polipeptidica lineare. Di conseguenza, la velocità con cui le proteine​legate all’SDS migrano attraverso il gel dipende principalmente dalla loro dimensione, consentendo la stima del loro peso molecolare mediante un confronto con degli standard proteici.

Native PAGE

Nell'elettroforesi su gel di poliacrilammide in condizioni native, le proteine sono separate in condizioni che consentono di preservarne la conformazione nativa (struttura terziaria), le interazioni tra subunità (struttura quaternaria e interazioni proteina-proteina) e l'attività biologica. In questa metodica, le proteine​vengono preparate e separate in condizioni non riducenti e non denaturanti. In tali condizioni la mobilità delle proteine​è determinata da una complessa combinazione di fattori; infatti, ogni proteina può migrare verso uno o l’altro degli elettrodi a seconda della sua carica, con una velocità di migrazione che dipende da parametri come la forma o la presenza di legami. Per questi motivi, la native PAGE non è adatta per la determinazione del peso molecolare. La native PAGE viene invece tipicamente utilizzata in applicazioni che richiedono la purificazione della proteina attiva o il rilevamento da parte di un anticorpo che riconosce solo la forma nativa della proteina.

Focalizzazione isoelettrica (IEF)

La focalizzazione isoelettrica fa uso di un campo elettrico e di un gradiente di pH per separare le proteine​in base al loro punto isoelettrico (pI). Quando le proteine si muovono attraverso il gradiente di pH, la loro carica netta cambia. Se soggetta ad un campo elettrico, ogni proteina migra in corrispondenza del pH dove la sua carica netta è pari a zero (punto isoelettrico della proteina). Durante il processo di separazione, le proteine nel campione si accumulano (focus) in posizioni specifiche e prevedibili del gel. La focalizzazione isoelettrica viene utilizzata nell'identificazione di proteine da campioni complessi (ad esempio, lisati di cellule e tessuti, plasma), nell’analisi delle modifiche post-traduzionali e nella separazione di campioni per le analisi di spettrometria di massa.

2D PAGE

L'elettroforesi su gel di poliacrilammide bidimensionale consente la risoluzione delle proteine in base sia al punto isoelettrico specifico (pI) che alla massa. La separazione in base al pI avviene tramite focalizzazione isoelettrica (IEF). La separazione in base alla massa avviene tramite SDS-PAGE. La 2D PAGE fornisce la massima risoluzione per l'analisi delle proteine​ed è comunemente usata nella ricerca proteomica per risolvere da centinaia a migliaia di proteine su un singolo gel.