Lisi cellulare ed estrazione di proteine

Sono disponibili numerosi metodi per disgregare le cellule e preparare il loro contenuto per l'analisi. In generale, per cellule facili da lisare, come quelle in coltura o le cellule del sangue, si ricorre a metodi delicati, mentre nel caso di cellule più resistenti, come le cellule batteriche o vegetali e le cellule di mammifero incorporate nel tessuto connettivo, vengono impiegati metodi più vigorosi.

• Lisi mediante detergenti: Lisi mediante detergenti: la lisi mediante detergenti è un metodo delicato che può essere utilizzato per cellule di mammifero, batteriche, di lievito e vegetali. Le sospensioni cellulari vengono delicatamente centrifugate e risospese in una soluzione di lisi contenente detergenti che agiscono rompendo la membrana cellulare. Le membrane vengono solubilizzate e si ottiene la lisi delle cellule e la liberazione del loro contenuto. I detergenti vanno rimossi nel caso possano interferire con le successive analisi o con la produzione.
• Lisi mediante congelamento-scongelamento: questo metodo è applicabile a sospensioni di cellule di mammifero o batteriche. La sospensione cellulare viene congelata rapidamente con azoto liquido. Il campione viene quindi scongelato e risospeso in un tampone di lisi pipettando o vortexando delicatamente e il processo viene ripetuto più volte. Tra un ciclo e l’altro, il campione viene centrifugato e il surnatante contenente la proteina solubile viene conservato.
• Shock osmotico: metodo molto delicato, può essere sufficiente per la lisi di cellule di mammifero o batteriche in sospensione senza fare uso di un detergente. Spesso combinato con la disgregazione meccanica, si basa sul passaggio da una soluzione ad alta osmolarità ad una a bassa osmolarità ed è adatto alle applicazioni in cui il lisato deve essere successivamente frazionato in diversi componenti subcellulari.
• Sonicazione: è un metodo per l’estrazione di proteine frequentemente applicato alle sospensioni di cellule. Le cellule vengono rotte da onde sonore ad alta frequenza generate da una sonda inserita nel campione. Le onde sonore generano una regione di bassa pressione che provoca la rottura delle membrane cellulari.
• Metodi meccanici: le proteine possono essere estratte da cellule e tessuti utilizzando varie tecniche di "frantumazione e triturazione", grezze ma efficaci. Ad esempio, le membrane cellulari possono essere disgregate per azione dello sforzo di taglio del liquido, utilizzando omogenizzatori Dounce o Potter-Elvehjem. Si possono omogeneizzare i tessuti tramite sminuzzamento o tritatura in tampone freddo con un frullatore Waring o un omogeneizzatore Polytron®. I tessuti o le cellule possono essere congelati in azoto liquido e ridotti in polvere fina aggiungendo della sabbia o allumina al campione e utilizzando un mortaio e un pestello. Per la maggior parte dei batteri Gram positivi e Gram negativi la parete cellulare può essere disgregata mediante rapida agitazione in presenza di piccole sfere di vetro.
• Digestione enzimatica: Digestione enzimatica: i metodi enzimatici sono spesso utilizzati per l’estrazione di proteine da batteri, lieviti o da cellule eucariotiche incorporate in tessuti fibrosi dove le membrane cellulari sono circondate da una robusta struttura protettiva. Enzimi o cocktail di enzimi per la lisi cellulare come i nostri Lisozima, Mutanolysin, MetaPolyzyme, Lysonase e Pronase, possono essere utilizzati in combinazione con enzimi per la digestione dei tessuti (ad esempio collagenasi, condroitinasi, ialuronidasi) per dissolvere o rompere diverse strutture quali parete cellulare, glicocalice, capsule, capsidi o altre strutture non facilmente aggredibili con i soli metodi meccanici. La digestione enzimatica è spesso seguita da omogeneizzazione, sonicazione o agitazione vigorosa con vortex in un tampone di lisi.

Inoltre, per evitare che le proteasi e le fosfatasi endogene liberate in seguito alla distruzione cellulare degradino la molecola target, il campione deve essere protetto durante la fase di lisi e la successiva purificazione utilizzando degli inibitori delle proteasi e delle fosfatasi