Quantificazione delle proteine
La quantificazione e i dosaggi delle proteinesono fondamentali per determinare con precisione la concentrazione delle proteinein un campione. Sono disponibili numerosi metodi per quantificare le proteine, tra cui la determinazione dell’assorbanza UV, dosaggi con reagenti chimici e tecniche immunologiche. Ciascuna di queste tecnologieoffre vantaggi specifici e la tipologia di dosaggio da preferire dipende dal tipo e/o dal volume di campione disponibile per l'analisi. Ad esempio, alcuni dei saggi a base di coloranti possono interferire con le sostanze chimiche presenti nel tampone e in questi casi può essere più appropriata la scelta di un saggio alternativo. I ricercatori devono tener conto dei limiti di ogni saggio per determinare quale sia l'opzione migliore per il loro campione.
Saggi di assorbanza nell’UV
La determinazione dell'assorbanza nell’ultravioletto (UV) è un saggio relativamente semplice per misurare la concentrazione delle proteine. La presenza di amminoacidi con catene laterali aromatiche (triptofano, tirosina, ecc.) determina il caratteristico assorbimento UV a 280 nm delle proteine. Pertanto, misurando con uno spettrofotometro l'assorbanza a questa particolare lunghezza d'onda si può stimare la concentrazione proteicadel campione. Questi saggi sono relativamente veloci e frequentemente utilizzati in laboratorio, solitamente viene usato il metodo di Warburg-Christian. Tuttavia, l'utilizzo dell'assorbanza UV per la misura della concentrazione proteica comporta un'elevata variabilità poiché i componenti non proteici in un campione possono interferire. Inoltre, la presenza di proteinedi diverso tipo in un campione potrebbe causare letture di assorbanza variabili a causa della differenza nelle composizioni amminoacidiche.
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Saggi con reagenti chimici
I problemi di compatibilità riscontrati con i metodi basati sull’assorbanza UV sono ovviati nei saggi che ricorrono a reagenti chimici. Citiamo, ad esempio, i dosaggi colorimetrici con il metodo dell’acido bicinconinico (BCA), il metodo di Lowry e quello di Bradford. Il metodo BCA e il metodo Lowry implicano entrambi la formazione di un complesso rame-proteine. Sono entrambi sensibili e meno variabili rispetto al dosaggio di Bradford. Tuttavia, il metodo di Bradford è rapido, facile da eseguire ed è compatibile con alcuni agenti riducenti, a differenza dei metodi BCA e di Lowry.
Saggi immunologici
In alcuni casi le metodiche descritte possono risultare inadeguate per l’accurata quantificazione delle proteine, ad esempio nel caso in cui il campione contenga diversi tipi di proteine o se queste sono presenti in quantità inferiori alla soglia di rilevamento. L’ analisi immunochimica utilizza diversi metodi di rilevamento e costituisce un metodo alternativo valido per quantificare con precisione le proteine in varie tipologie di campione. Ad esempio, i saggi multiplex consentono ai ricercatori di quantificare più tipi proteine contemporaneamente in un certo campione. Inoltre, la tecnologia di conteggio delle singole molecole è in grado di misurare le proteine presenti in campioni poco abbondanti o in quantitativi molto bassi, nell’ordine dei femtogrammi. Le applicazioni della ricerca che utilizzano queste tecnologie includono la misurazione dei biomarcatori presenti nei tessuti sani o in quelli associati alla progressione della malattia per comprenderne meglio l’evoluzione.
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