Immunoistochimica

Preparazione dei tessuti, recupero dell'antigene e pretrattamento per IHC

In generale, per l'analisi in IHC, i tessuti vengono fissati, incorporati in paraffina e sezionati utilizzando un microtomo. Una fase cruciale dopo la preparazione iniziale del tessuto consiste nel recupero dell'antigene. Essa è necessaria per rompere i legami crociati delle proteine​che si possono formare durante la fissazione e rendere così accessibili i siti antigenici nascosti. Le condizioni per il recupero dell'antigene e il pretrattamento vanno determinate empiricamente in quanto l'accessibilità dell'epitopo antigenico può variare in modo significativo a seconda di numerosi fattori biologici. Ad esempio, alcuni antigeni potrebbero richiedere un pretrattamento più aggressivo per "smascherare" gli epitopi in grado di legare l’anticorpo, mentre per altri antigeni il pretrattamento potrebbe non essere necessario. I metodi comunemente usati per il recupero dell'antigene sono due: il primo è il recupero dell'epitopo indotto dal calore o HIER che utilizza una fonte di calore insieme a specifici tamponi e al trattamento enzimatico (proteinasi K); il secondo è il recupero dell’antigene indotto da proteolisi o PIER nel quale si possono utilizzare vari tipi di proteasi, come la proteinasi k, la tripsina, la chimotripsina o la pepsina.

Colorazione e rilevamento in IHC

Dopo la preparazione del tessuto e il pretrattamento per il recupero dell'antigene, la visualizzazione dell'interazione anticorpo-antigene può essere eseguita in diversi modi. Un metodo comune utilizza un anticorpo primario coniugato a un enzima, come la perossidasi di rafano o la fosfatasi alcalina, che catalizza una reazione che produce colore. In alternativa, il metodo dell’immunofluorescenza (IF) ricorre a un anticorpo marcato con un fluoroforo, come fluoresceina, rodamina o Alexa Fluor. Un'altra opzione è quella di utilizzare un anticorpo primario privo di marcatura, con un rilevamento indiretto dell’antigene da parte di un anticorpo secondario marcato o mediante sistemi di rilevamento più complessi. In questo caso, è necessario determinare per ciascun saggio il titolo ottimale di entrambi gli anticorpi, primario e secondario.