Saggi per la determinazione dell’attività enzimatica
I saggi per la determinazione dell’attività enzimatica vengono eseguiti al fine di identificare la presenza o la quantità di un enzima specifico in un organismo, un tessuto o un campione. Esempi di tali enzimi includono α-amilasi, catalasi, laccasi, perossidasi, lisozima e gli enzimi reporter fosfatasi alcalina e luciferasi. Sono stati messi a punto diversi reagenti e metodiche per studiare le specifiche interazioni enzima-substrato. La scelta della procedura operativa più appropriata dipende dalla sensibilità richiesta dal ricercatore. Nell’analisi dell’attività enzimatica le applicazioni di tipo colorimetrico sono più adatte per il rilevamento, mentre i reagenti basati sulla fluorescenza sono più indicati per la quantificazione.
Determinazione delle condizioni ottimali per l'attività enzimatica
Sebbene in letteratura siano descritti numerosi saggi enzimatici, le procedure utilizzate vanno comunque sempre ottimizzate in relazione ai requisiti specifici dell'enzima in esame. L'attività specifica di un enzima dipende da numerosi fattori tra cui pH, temperatura, forza ionica oltre che dalla concentrazione di tutti i componenti del saggio. Per parametri come il pH, l'attività enzimatica spesso segue a una curva a campana. In corrispondenza di un pH specifico l’attività enzimatica risulta massima (Vmax), mentre va decrescendo via via ci si avvicina alle due estremità della curva. Alcuni enzimi possono richiedere considerazioni aggiuntive riguardo ai composti non direttamente coinvolti nella reazione, come ioni metallici, detergenti e molecole idrofobe.
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Componenti del dosaggio enzimatico
L’acqua costituisce il solvente standard per moltissimi enzimi; del resto, acquoso è l’ambiente cellulare. Tuttavia, nel caso di enzimi o componenti enzimatici insolubili in acqua si ricorre a solventi organici. Anche i substrati e i cofattori, rivestendo un importante ruolo nell’attività catalitica dell’enzima, rappresentano dei componenti critici di cui tener conto nei saggi di attività enzimatica. Essi vengono spesso identificati in base alla loro funzione in condizioni fisiologiche, là dove I’interazione con specifici substrati e cofattori risulta necessaria all’attività di una vasta gamma di enzimi. Altri elementi critici da considerare sono i tamponi e gli ioni che sono essenziali per stabilizzare il pH durante il saggio e quindi in grado di influenzare direttamente l'attività enzimatica. Ad esempio, ioni metallici mono o bivalenti possono essere necessari per l'attività catalitica dei cofattori e, quindi, anche per l'attività enzimatica.
Esecuzione di un saggio enzimatico
Il primo passaggio per la preparazione di un saggio enzimatico consiste nella preparazione di una miscela contenente i diversi componenti. In generale è preferibile preparare un grande volume di miscela, escludendo però un componente attivante, per evitare gli errori di pipettaggio che sono inevitabili quando si trattano piccoli volumi. Una volta preparata la miscela, il ricercatore aggiungerà il componente attivante che darà inizio al saggio. Prima che il saggio abbia inizio, si provvede al pretrattamento dell’enzima che consiste nella conservazione a basse temperature e, spesso, nell’aggiunta di vari additivi chimici o proteici. Questo assicura la stabilità e conserva la massima attività dell’enzima per il saggio pianificato. Una volta aggiunti tutti i componenti questi vanno miscelati rapidamente e accuratamente per dare inizio della reazione. La registrazione dei dati deve iniziare immediatamente dopo la miscelazione e il segnale rilevabile deve venire riportato graficamente per l'intera durata della reazione.
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