Marcatura e rilevamento degli acidi nucleici
La gamma dei metodi usati per la marcatura e il rilevamento di acidi nucleici, prodotti della PCR e oligonucleotidi è molto vasta. Il tipo di reagenti e di metodica usati per marcare e rilevare gli acidi nucleici è determinato da diversi fattori, tra cui il tipo di molecola che verrà marcata e l'applicazione a cui è destinata. Per marcare gli acidi nucleici vengono quindi usati sia metodi enzimatici che chimici mediante l’incorporazione di molecole di diverso tipo come fluorofori, enzimi ed elementi radioattivi.
MATCATURA DI ACIDI NUCLEICI E SONDE
Gli acidi nucleici possono essere marcati lungo tutta la molecola o limitatamente alle estremità 5' e 3'. Le sonde di acidi nucleici sono particolarmente utili per i saggi di ibridazione, come il rilevamento dell’RNA in Northern blot o del DNA in Southern blot. Per marcare la sonda vengono utilizzati diversi metodi, inclusa la PCR con deossinucleotidi marcati (dNTP) o nucleotidi trifosfati (NTP), random priming e nick translation. La marcatura al livello delle estremità è particolarmente utile per i saggi che studiano le interazioni acido nucleico-proteina, per evitare l'ingombro sterico.
Saggi di marcatura e rilevamento degli acidi nucleici
La tecnica di rilevamento usata dipende dal tipo di marcatura utilizzata: il rilevamento colorimetrico è spesso utilizzato per le sonde marcate con enzimi, mentre il rilevamento autoradiografico è adatto per le sonde radioattive. Le sonde più comunemente usate sono quelle marcate con digossigenina (DIG) o fluoresceina e possono essere utilizzate in combinazione per facilitare il rilevamento di sonde multicolore quando accoppiate a reazioni colorimetriche (ad es. fosfatasi alcalina). Un ulteriore metodo di marcatura consiste nell’incorporazione di biotina-16-dUTP ottenibile mediante PCR utilizzando la maggior parte delle DNA polimerasi. La FISH (ibridazione in situ fluorescente) utilizza sonde fluorescenti per rilevare specifiche sequenze di DNA; il successo del rilevamento e delle analisi successive dipendono in parte anche dalla sensibilità e dalla risoluzione del microscopio a fluorescenza a disposizione del ricercatore.
Applicazioni che utilizzano DNA e RNA marcati
Il trasferimento di macromolecole su membrane in fase solida è noto come blotting. Grazie alla specificità delle sonde marcate, l'ibridazione tra acido nucleico e sonda fornisce ai ricercatori la possibilità di rilevare sequenze sia di DNA che di RNA in miscele complesse di acidi nucleici. Inoltre, queste metodiche consentono di raccogliere importanti informazioni circa l'espressione genica, le dimensioni e il numero di copie di RNA a seconda del test utilizzato. Anche l’ibridazione in situ viene comunemente usata dai ricercatori per rivelare una o più sonde marcate con differenti marcature (ad esempio con DIG e fluoresceina).
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