Clonaggio ed espressione di proteine

Vettori per l’espressione di proteine

I plasmidi, o vettori per l’espressione di proteine, sono frammenti circolari di DNA contenenti numerosi elementi funzionali che consentono il clonaggio e l'espressione della proteina di interesse. La scelta del vettore di espressione appropriato è in parte determinata dal tipo di proteina in esame, dal tipo di sistema che la esprimerà, dall'applicazione a cui è destinata e dai quesiti scientifici che il ricercatore intende affrontare. L'ampia varietà di vettori di espressione disponibili consente ai ricercatori di scegliere gli elementi di clonaggio, selezione, ed espressione proteica più adatti per il proprio studio. Una volta selezionati la sequenza genica di interesse e il vettore di espressione, i ricercatori utilizzano delle nucleasi per tagliare il vettore in siti specifici e clonare in frame al suo interno la sequenza che verrà poi espressa in un organismo ospite. I ricercatori useranno quindi delle cellule competenti e il processo di trasformazione batterica per consentire l’entrata nella cellula dei plasmidi di DNA ricombinante; i batteri possono quindi essere conservati congelati a -70 °C.

Come trasfettare le cellule

La trasfezione consiste nel processo di introduzione di DNA o RNA o proteine​nelle cellule eucariotiche. Una varietà di tecnologie fisiche, chimiche e biologiche è a disposizione dei ricercatori per realizzare questa fase del processo di espressione delle proteine. I metodi di trasfezione più comunemente utilizzati sono quelli fisici, come l'elettroporazione, o chimici, come il trattamento con fosfato di calcio (CaPi) o con polietilenimmina (PEI), oppure la lipofezione. In alternativa, si può ricorrere alla trasduzione mediata da vettori derivati da virus, come lentivirus, onco-retrovirus e adenovirus. Un limite all'utilizzo della trasduzione consiste nel fatto che spesso essa richiede misure di contenimento e di monitoraggio aggiuntive per motivi di biosicurezza.

Sistemi di espressione delle proteine

Vari organismi vengono utilizzati dai ricercatori per esprimere la proteina di interesse. I batteri sono comunemente usati in quanto consentono un ingresso efficiente dei vettori di espressione, hanno tempi di riproduzione rapidi e, in condizioni ottimali, possono produrre elevate quantità di proteine​ricombinanti. Tuttavia, essendo organismi procarioti, i batteri non sono in grado di effettuare le modifiche post-traduzionali richieste per alcune proteine. Nel caso di proteine che richiedano modifiche post-traduzionali i ricercatori useranno come sistema di espressione cellule eucariotiche, come le linee cellulari di lievito e di mammiferi, che sono in grado di effettuare tali modifiche. La scelta della linea cellulare ottimale per l'espressione della proteina ricombinante e la strategia di espressione della proteina dipendono fortemente dalle specifiche esigenze applicative e dalle domande che lo scienziato si propone di affrontare.