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PCR quantitativa (qPCR)

qPCR basata su SYBR green

La PCR quantitativa in tempo reale (qPCR) usa molecole reporter fluorescenti per consentire la quantificazione dei prodotti amplificati. Come nella PCR convenzionale si amplificano stampi di DNA, cDNA o RNA, ma ad ogni ciclo si misura la fluorescenza per la quantificazione relativa o assoluta. Questa tecnica è utile in numerose aree della ricerca come l’analisi di espressione genica, la genotipizzazione, l’analisi di microRNA, l’analisi di variazione genetica e l’analisi di proteine.

Come analizzare i dati della qPCR

Si misura e quantifica la fluorescenza delle molecole reporter che tipicamente sono coloranti (es. SYBR®green, bromuro di etidio) che si intercalano fra le basi di DNA a doppio filamento, o sonde disegnate per legare una determinata sequenza di DNA (es. fari molecolari, sonde TaqMan®).

Quantificazione relativa dei dati della qPCR

Ci sono due metodi principali di quantificazione per i dati della qPCR. La quantificazione relativa, il metodo più comune, utilizza l’informazione ΔΔCt da cui si ricava il rapporto di espressione o abbondanza del gene bersaglio nel campione che viene confrontato con un gene di controllo e normalizzato contro il rapporto di espressione di un gene di riferimento. Poiché i valori di efficienza E per i geni bersaglio e di riferimento sono diversi, questo metodo spiega anche le differenze nei valori E. Questo metodo è impiegato più di frequente nell’analisi dell’espressione genica.

Quantificazione assoluta dei dati della qPCR

Il secondo metodo, quantificazione assoluta, è più comune in microbiologia ambientale e ricorre alla curva standard (SC). Il metodo basato sulle curve (SC) impiega diluizioni seriali di un templato a concentrazione nota, N0, per creare una curva di calibrazione standard usando la regressione lineare di log(N0) rispetto al CT (ciclo soglia). Questa viene poi usata per calcolare le concentrazioni del templato nel campione. Il metodo si basa sull’assunzione che il valore di efficienza del campione sia uguale a quello dello standard.

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