Nucleases (DNases e RNases)

Endonucleases de restrição

Nucleases para digestão de DNA e RNA

Nossas nucleases variam de acordo com a especificidade da clivagem e determinadas propriedades, como pH ideal, permitindo que o pesquisador escolha a enzima digestiva mais adequada aos requisitos do experimento. A desoxirribonuclease I de mamíferos, por exemplo, produz produtos com a terminação 5' P1 de Penicillium citrinum - degrada DNA e RNA de fita simples, mas não DNA dupla-fita. A ribonuclease A hidrolisa qualquer RNA contaminante em amostras de proteínas ou preparados de DNA plasmidial. Muitas dessas enzimas têm usos adicionais em aplicações de biologia molecular. Por exemplo, a DNase I faz pequenos “cortes" no DNA para permitir a incorporação de bases marcadas. A RNase A é uma ferramenta no ensaio de proteção com RNases que mede a abundância de mRNAs específicos.

Enzimas DNase desoxirribonuclease I e desoxirribonuclease II

A desoxirribonuclease I catalisa a clivagem endonucleolítica de DNA de fita dupla e simples para produzir produtos com extremidades 5'-fosfodinucleotídeo e 5'-fosfoligonucleotídeo. O produto da hidrólise é uma mistura complexa de mononucleotídeos e oligonucleotídeos 5'-fosfato. Na presença de íons de magnésio, a DNAse I ataca cada fita de DNA de modo independente e os sítios de clivagem são aleatórios. Na presença de manganês (II), a DNase I cliva ambas as fitas de DNA aproximadamente no mesmo sítio. A maioria dos protocolos usa íons de magnésio com DNase I, mas para fins específicos, o manganês é usado. Além disso, a desoxirribonuclease II catalisa a clivagem endonucleolítica de DNA de fita dupla e simples para produzir os nucleosídeos 3’-fosfatos e produtos com extremidades 3'-fosfoligonucleotídeo. A faixa de pH para atividade é de 4,0 a 6,5, com apenas cerca de 15% em pH 6,5 e pH ideal 5,0. A estabilidade ideal da enzima ocorre em pH 5 a 5,5, com rápida inativação em pH 8,5 a 30 °C. Oferecemos uma ampla coleção de enzimas DNase para apoiar diversos tipos de amostras e aplicações. Quer estejam na forma liofilizada ou líquida, algumas das nossas DNAses incluem concentrações significativamente baixas de RNases ou proteases para proteger sua amostra contra digestão indesejada.

Enzimas RNase ribonuclease A, ribonuclease H e ribonuclease T₁

A ribonuclease A catalisa a clivagem endonucleolítica do RNA para produzir nucleosídeos 3'-fosfatos e 3'-fosfoligonucleotídeos terminando em Cp ou Up. Os ativadores da RNase A incluem sais de potássio e sódio. A temperatura ideal para a atividade é 60 °C, embora a enzima apresente atividade de 15 ºC a 70 °C. O pH ideal é 7,6, com um intervalo de atividade de 6 a 10. A atividade máxima é exibida com RNA de fita simples. A RNase A é uma enzima muito estável e pode suportar temperaturas de até 100 °C. A 100 °C, a RNase A é mais estável entre pH 2,0 e 4,5. A ribonuclease H hidrolisa especificamente as ligações fosfodiéster do RNA em duplas de RNA:DNA para gerar produtos com extremidades 3'-hidroxila e 5'-fosfato. Ela degrada apenas o componente de RNA do híbrido DNA-RNA (RNA ligado por ponte de hidrogênio a uma fita de DNA complementar).

Além disso, a ribonuclease T₁ catalisa a clivagem endonucleolítica do RNA em duas etapas para produzir nucleosídeos 3'-fosfatos e 3'-fosfoligonucleotídeos terminados primordialmente em Gp. Na reação, a clivagem ocorre entre o grupo 3'-fosfato de um ribonucleotídeo de guanidina e o grupo 5'-hidroxila do nucleotídeo adjacente. O produto inicial é um nucleosídeo de fosfato 2':3' cíclico que é hidrolisado no nucleosídeo 3'-fosfato correspondente. Em solução, ela é resistente ao calor (100 °C por 10 minutos em pH 6) e a acidez, porém instável em solução alcalina (pH >9). Deve-se notar que a reação catalisada pela enzima não pode ser interrompida aquecendo a mistura de reação a 100 °C. Oferecemos uma ampla linha de enzimas RNase para apoiar diversos tipos de amostras e aplicações. Quer estejam na forma liofilizada ou líquida, algumas das nossas RNAses incluem concentrações significativamente baixas de proteases para proteger sua amostra contra clivagem proteica indesejada.