Expressão de proteínas
Avanços em genômica, clonagem e inúmeras técnicas de biologia molecular permitem aos pesquisadores expressar proteínas heterólogas em diversos sistemas biológicos. A capacidade de expressar proteínas recombinantes fornece aos pesquisadores uma ampla gama de aplicações poderosas a jusante (downstream) para outras pesquisas. Em pequena escala, a superexpressão de proteínas pode facilitar estudos voltados à compreensão da função de proteínas; ao passo que a produção de proteínas em larga escala é essencial para a produção de enzimas, anticorpos e vacinas. A determinação de condições ideais de crescimento celular e expressão proteica é fundamental para sistemas de expressão de proteínas em pequena e larga escala. Independente de ser um sistema de expressão procariótico ou eucariótico necessário para modificações pós-traducionais, o tipo de célula determinará em grande parte quais ferramentas e reagentes são necessários para a expressão proteica ideal.
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Vetores de expressão proteica
Os vetores de expressão ou plasmídeos são sequências circulares de DNA que são comumente usadas pelos pesquisadores como uma ferramenta para hospedar o gene que codifica a sua proteína de interesse. Os plasmídeos contendo o gene de interesse são posteriormente transformados ou transfectados em células para superexpressar a proteína. Os plasmídeos contêm vários elementos úteis que facilitam a clonagem, seleção de clones, expressão e purificação de proteínas, incluindo, mas não limitado a um sítio de clonagem múltipla (multiple cloning site (SCM)), genes de resistência a antibióticos usados para seleção de clones, caudas exclusivas para identificação e purificação de proteínas, além de regiões promotoras potentes para promover a expressão proteica. Há uma grande variedade de vetores de expressão proteica, pois muitos desses elementos são intercambiáveis dependendo das necessidades específicas da aplicação e do tipo celular usado para expressão proteica.
Sistemas de expressão de proteínas bacterianas, de mamíferos e outras
Com a cinética de rápido crescimento e transformações de plasmídeos em E. coli ocorrendo em apenas alguns minutos, as bactérias são o organismo de escolha para a produção de proteínas recombinantes. A expressão de proteínas bacterianas depende das subunidades ribossômicas 30S e 50S do ribossomo bacteriano 70S. Para evitar o crescimento de células livres de plasmídeos, plasmídeos contendo genes resistentes a antibióticos são usados como método de seleção para identificar e isolar bactérias que incorporaram plasmídeos contendo a sequência de codificação da proteína de interesse. Embora o sequenciamento genético adicional seja frequentemente necessário para confirmar a presença de sua sequência gênica, vários antibióticos que bloqueiam a síntese de proteínas bacterianas são comumente usados para remover bactérias livres de plasmídeos. Além de linhagens celulares bacterianas, linhagens de insetos, leveduras e mamíferos também são comumente usadas para expressão proteica. No entanto, diferentemente das bactérias, as linhagens celulares eucarióticas contêm a maquinaria molecular adicional para gerar modificações pós-tradução (como, por exemplo, glicosilação) e são muitas vezes essenciais para a funcionalidade da proteína e análises a jusante (downstream) significativas.
Aplicações da expressão de proteínas recombinantes
As proteínas recombinantes são proteínas que são codificadas dentro de plasmídeos que expressam proteínas e que foram modificados para maximizar a expressão/purificação de proteínas ou mutadas para avaliar a função proteica. A capacidade de adicionar, remover ou alterar a sequência codificadora da proteína, mesmo por um único nucleotídeo, fornece aos pesquisadores uma ferramenta muito poderosa para investigar diversas questões fundamentais de pesquisa e elucidar a função da proteína em tecidos saudáveis e doentes. As implicações da tecnologia de expressão de proteínas recombinantes vão muito além das aplicações de pesquisa básica e são essenciais para o desenvolvimento de agentes terapêuticos e vacinas que salvam vidas.
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