Citometria de fluxo
A citometria de fluxo é uma tecnologia que usa lasers individuais ou múltiplos para fornecer uma análise multiparamétrica de células únicas. Cada célula ou partícula é analisada por dispersão de luz visível ou por fluorescência à medida que as células fluem rapidamente através de cada laser. Independente da análise de dispersão de luz, as medidas de fluorescência são obtidas pela transfecção e expressão de proteínas fluorescentes comuns (como por exemplo, de proteína verde fluorescente, GFP) e coloração com anticorpos conjugados com fluorescência ou corantes fluorescentes. A citometria de fluxo é uma tecnologia poderosa que é comumente usada em aplicações de pesquisa em biologia molecular e celular, incluindo imunologia, oncologia e pesquisa de doenças.
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Anticorpos e marcações para citometria de fluxo
Realizar uma análise de citometria de fluxo envolve utilizar vários anticorpos e marcações para citometria de fluxo. Os anticorpos para citometria de fluxo são usados para se ligar especificamente a diferentes marcadores celulares, ajudando a caracterizar o tipo de célula e avaliar quaisquer alterações na expressão proteica como parte do experimento. Vários tipos de marcações podem ser usados para visualizar os anticorpos para detecção no citômetro de fluxo, dependendo do desenho experimental, incluindo corantes de ácidos nucleicos, corantes de viabilidade celular, corantes de polímeros, pontos quânticos, pequenas moléculas orgânicas e proteínas fluorescentes. Os anticorpos são tipicamente marcados por meio da conjugação direta (como produtos disponíveis no mercado ou kits de conjugação que permitem que o usuário final realize a reação) ou por meio do uso de anticorpos secundários. Uma nova tecnologia de citometria de fluxo exclusiva permite que os usuários finais misturem e combinem, de forma flexível, anticorpos e corantes selecionados independentemente para agrupá-los em qualquer combinação, sem o uso de kits de conjugação ou anticorpos secundários.
Aplicações da citometria de fluxo
Inúmeros campos de estudo usam citometria de fluxo e analisam com frequência múltiplos parâmetros em populações de células diversas. Aplicações comuns de biologia molecular incluem a análise de proteínas fluorescentes expressas de modo recombinante que induzem a expressão em vários tipos celulares para elucidar a função dos genes, ou para rastreamento celular in vivo. Enquanto a coloração do DNA viabiliza a análise do ciclo celular, o uso de anticorpos possibilita uma ampla gama de análises, como expressão proteica, RNA e transdução de sinal. No entanto, a imunofenotipagem é uma das aplicações mais comumente utilizadas da citometria de fluxo. Com a imunofenotipagem, anticorpos conjugados com fluorocromos têm como alvo múltiplos antígenos de superfície celular para identificar células imunes específicas dentro da população de células.
Análise de dados de citometria de fluxo
A análise de dados de citometria de fluxo muitas vezes envolve identificar uma região específica de células ou aglomeração e aplicar parâmetros adicionais no experimento, incluindo averiguar se fatores adicionais de identificação celular estão presentes para obter mais informações sobre a identidade celular. Inúmeros programas de software estão disponíveis e são comumente usados para facilitar esse tipo de análise de dados e outras análises do ciclo celular.
Instrumentação da citometria de fluxo
Um resumo dos componentes primários usados nos citômetros de fluxo inclui componentes eletrônicos, ópticos e de fluídica. Os componentes de fluídica atuam como o sistema de distribuição de líquidos para direcionar a amostra para os componentes ópticos, os quais envolvem óptica de excitação (laser), e para os componentes ópticos de coleta, que consistem em fotodiodos e tubos fotomultiplicadores (PMTs). É importante ressaltar que os componentes eletrônicos convertem as informações dos detectores em sinais digitais que são interpretados por computadores. Combinações de sistemas adicionais facilitam análises de amostras mais avançadas, incluindo o uso de separadores celulares para purificar e coletar amostras, e citômetros de imagem que combinam citometria de fluxo com microscopia de fluorescência.
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