Lise e extração de proteínas

Há vários métodos disponíveis para romper células e preparar seus conteúdos para análise. Em geral, métodos menos enérgicos são empregados quando a amostra consiste de células em cultura ou células sanguíneas facilmente lisadas, enquanto métodos mais enérgicos são empregados para romper células bacterianas ou vegetais mais robustas, ou células de mamíferos embebidas em tecido conjuntivo.

• Lise à base de detergente: Lise à base de detergente: A lise com detergente é um método menos enérgico que pode ser usado para células de mamíferos, células bacterianas, leveduras e plantas. As suspensões celulares são cuidadosamente centrifugadas e ressuspensas em solução de lise contendo detergentes que atuam para romper a membrana celular. As membranas são solubilizadas, lisando as células e liberando seu conteúdo. Pode ser necessário remover os detergentes a jusante do processo, caso interfiram na análise ou produção.
• Lise por congelamento e descongelamento: Este método é aplicável a suspensões de células de mamíferos ou bacterianas. A suspensão de células é rapidamente congelada usando nitrogênio líquido. A amostra é, então, descongelada e ressuspensa por pipetagem ou centrifugação leve em tampão de lise, repetindo o processo várias vezes. Entre os ciclos, a amostra é centrifugada, e o sobrenadante contendo proteína solúvel é retido.
• Choque osmótico: Este é um método muito leve que pode ser suficiente para lisar células de mamíferos ou bacterianas suspensas sem usar um detergente. O método, muitas vezes combinado com rompimento mecânico, requer a mudança de um meio altamente osmótico para um meio pouco osmótico, e é adequado para aplicações nas quais o lisado deve ser posteriormente fracionado em componentes subcelulares.
• Ultrassonicação: Este método de extração de proteínas é mais frequentemente aplicado a suspensões celulares. As células são rompidas por ondas sonoras de alta frequência por meio de uma sonda inserida na amostra. As ondas sonoras geram uma região de baixa pressão, causando a ruptura das membranas celulares.
• Métodos mecânicos: As proteínas podem ser extraídas das células e tecidos usando várias medidas de "esmagamento e moagem" brutas, porém eficazes. Por exemplo, as membranas celulares podem ser rompidas por forças de cisalhamento líquido usando a homogeneização de Dounce ou Potter-Elvehjem. Os tecidos podem ser homogeneizados cortando-se ou moendo-os em tampão refrigerado usando um liquidificador de Waring ou homogeneizador Polytron®. Os tecidos ou células podem ser congelados em nitrogênio líquido e moídos até formar um pó fino, usando um almofariz e pilão com alumina ou areia. A rápida agitação das células com esferas de vidro finas rompe as paredes celulares, sendo eficaz para a maioria das bactérias gram-positivas e gram-negativas.
• Digestão enzimática: Digestão enzimática: Métodos enzimáticos são frequentemente usados na extração de proteínas de bactérias, leveduras ou células eucarióticas embebidas em tecidos fibrosos onde as membranas celulares são cercadas por uma estrutura protetora robusta. Enzimas ou coquetéis de lise celular, como lisozima, mutanolisina, MetaPolyzyme, Lysonase e pronase, podem ser usados em combinação com enzimas de digestão de tecidos (ou seja, colagenase, condroitinase, hialuronidase) para dissolver ou romper as paredes celulares, revestimentos, cápsulas, capsídeos ou outras estruturas que não são facilmente cisalhadas apenas usando métodos mecânicos. A digestão enzimática é frequentemente seguida de homogeneização, sonicação ou centrifugação vigorosa em um tampão de lise.

Além disso, como as proteases e fosfates endógenas podem ser liberadas após o rompimento celular e degradação da molécula-alvo, a amostra deve ser protegida durante o rompimento da célula e posterior purificação usando inibidores de proteases e fosfatases para evitar a perda não controlada do material desejado.