Testes de Mycoplasma no setor farmacêutico
A contaminação por Mycoplasma é um problema comum e recorrente em muitos sistemas de cultura celular em pesquisas de ciências biológicas e no setor farmacêutico. As bactérias do tipo micoplasma podem atingir altas concentrações em meios de cultura sem exibir os sinais típicos de contaminação bacteriana, como turbidez. Seus efeitos em células cultivadas incluem metabolismo alterado, retardo da proliferação e aberrações cromossômicas. Em suma, a contaminação por Mycoplasma compromete a validade dos dados das linhagens celulares afetadas e os resultados das pesquisas na área de ciências biológicas. Isso torna os testes de Mycoplasma e, portanto, a manutenção das culturas celulares livres de contaminação, fundamentais para a pesquisa baseada em células e para a fabricação de mercadorias em que a saúde do consumidor é uma preocupação importante.
Sobre as bactérias do gênero Mycoplasma
Os micoplasmas estão entre as menores bactérias de que se tem conhecimento, sendo capazes de atravessar filtros com tamanho de poro de 0,2 µm. Esses microrganismos crescem aerobiamente ou em condições anaeróbias facultativas.
Os micoplasmas são parasitas ou saprófitas. Diversas espécies, por exemplo M. pneumoniae, são patogênicas, causando pneumonia e outros distúrbios respiratórios em humanos. A M. genitalium está supostamente envolvida em doenças inflamatórias pélvicas. Por serem bactérias que não têm parede celular, os micoplasmas não são suscetíveis a penicilinas ou outros antibióticos que atuam nesta estrutura. Para estabilizar suas membranas citoplasmáticas, a maioria dos micoplasmas necessita de esterois, os quais captam do seu ambiente, em geral, na forma de colesterol de seus animais hospedeiros. Muitas cepas de Mycoplasma também apresentam tolerância a diversos outros antibióticos.
Fontes de contaminação por Mycoplasma
As fontes de contaminação por Mycoplasma no laboratório e na fabricação são muito difíceis de controlar. Algumas espécies são encontradas na pele humana e podem ser introduzidas em culturas através de práticas assépticas ruins. Além disso, os micoplasmas podem ser introduzidos através de suplementos contaminados, como soro bovino fetal, ou mais comumente pela transmissão a partir de outras culturas celulares contaminadas. Quando uma cultura celular contém micoplasmas, esses microrganismos podem se espalhar rapidamente e contaminar outras áreas do laboratório por aerossóis e partículas geradas durante o manuseio da cultura. A adesão rigorosa a boas práticas laboratoriais assépticas é fundamental, e testes rotineiros em culturas são altamente recomendados para o controle bem-sucedido de contaminação por micoplasma em áreas de produção.
Por que fazer testes de Mycoplasma no setor farmacêutico?
Instalações biofarmacêuticas que usam células eucarióticas para produção de vacinas precisam testar seus bancos de células e lotes de inóculo viral, bem como vacinas a granel, quanto à contaminação por Mycoplasma. As espécies deste gênero bacteriano infetam células eucarióticas, perturbando seu crescimento e metabolismo. Quando micoplasmas interferem na produção de vacinas, isso pode afetar a qualidade e o rendimento de proteínas e, mais importante, causar efeitos colaterais em pacientes que recebem a aplicação da vacina como produto final.
A contaminação de um biorreator por micoplasmas pode levar a uma significativa perda de tempo, materiais e receita se não for identificada no início do processo de fabricação. Sem rotinas de testes rigorosos, a contaminação de lotes de produção biofarmacêutica por Mycoplasma é extremamente difícil de ser detectada, porque, em geral, a presença de micoplasmas não causa alterações de pH ou turbidez visual nos meios de cultura. O método de teste de Mycoplasma compendial envolve tanto testes de culturas quanto testes de indicadores em cubetas para detecção. Se apenas dois meios forem usados para análise, recomenda-se usar os meios FREY e FRIIS em combinação.
Métodos de teste de Mycoplasma
É importante testar produtos biofarmacêuticos, vacinas, culturas celulares e culturas de vírus quanto à presença de micoplasmas em vários pontos durante o controle de qualidade. Os três métodos de teste mais comuns são:
- Cultura de Mycoplasma, onde meio de cultura bacteriano otimizado para micoplasmas é inoculado com amostras de teste
- Métodos de coloração de DNA, onde os núcleos de micoplasmas são corados com corante de contraste Hoechst ou DAPI e observados em microscopia de fluorescência
- PCR (reação em cadeia da polimerase), para amplificar o DNA bacteriano, se houver micoplasmas presente na amostra
Fluxo de trabalho para detecção de micoplasmas segundo a EP 2.6.7 e a USP 63
*Nos dias após a inoculação, faça o subcultivo de cada meio líquido inoculando 0,2 ml deles em pelo menos 1 placa de cada meio sólido. Repita o procedimento entre o 6o e o 8o dia, novamente entre o 13o e o 15o dia e mais uma vez entre o 19o e o 21o dia do teste. Observe os meios líquidos a cada 2 ou 3 dias e, se ocorrer uma alteração de cor, subcultive.
Observação: Além disso, são necessários um controle positivo e um negativo por meio sólido e líquido, com um tempo de incubação de 14 dias.
Meios prontos para uso para detecção compendial de Mycoplasma
Oferecemos um portfólio completo de meios de cultura líquidos e sólidos prontos para uso, que são necessários para detectar micoplasma segundo a Farmacopeia Europeia 6.1 (2.6.7) e a Farmacopeia americana (USP) 35 (63). Sem mais nenhuma outra etapa de preparo, nossos meios de cultura de Mycoplasma prontos para uso garantem uma qualidade constante de produtos e rastreabilidade total com certificados de análise específicos para cada lote.
Devido a seus ingredientes, os meios para Mycoplasma geralmente têm vida útil bem menor que a maioria dos outros meios de cultura para controle de qualidade microbiológico. A vida útil dos nossos meios de Friis, Frey e Hayflick líquidos e sólidos prontos para uso foram prolongados para 4 meses para as placas de ágar e 6 meses para os caldos. Experimente nossa linha completa de meios de cultura prontos para uso com validade mais longa para facilitar os testes de Mycoplasma.
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