Metabolizm leków w fazie I

Robert Gates

MilliporeSigma, St. Louis

Reakcje biotransformacji fazy I wprowadzają lub eksponują grupy funkcyjne leku w celu zwiększenia polarności związku. Chociaż metabolizm leków w fazie I zachodzi w większości tkanek, głównym i pierwszym miejscem metabolizmu jest krążenie wątrobowe. Dodatkowy metabolizm zachodzi w tkankach nabłonka przewodu pokarmowego, nerek, skóry i płuc. W komórkach większość enzymów fazy I znajduje się w retikulum endoplazmatycznym, a zatem są one wzbogacone w preparaty mikrosomalne.

Reakcje fazy I są ogólnie pogrupowane w trzy kategorie: utlenianie, redukcja i hydroliza. Ponieważ większość leków drobnocząsteczkowych ma charakter lipofilowy, metabolizm leków przekształca te hydrofobowe związki w związki bardziej rozpuszczalne w wodzie, które mogą być wydalane. Zazwyczaj utlenianie jest najczęstszą reakcją fazy I. Wątrobowy układ cytochromu P450 jest najważniejszym z układów utleniania fazy I (Rysunek 1).

Rysunek 1. Nasze wątrobowe mikrosomalne enzymy cytochromu P450 są związanymi z błoną oksygenazami zawierającymi hem tiolanowy w pobliżu miejsca aktywnego. Oddawanie elektronów dla mechanizmu utleniania jest dostarczane ze sprzężonego układu reduktazy NAD(P)H i cytochromu b5. Do niedawna trudności z izolacją i odtworzeniem natywnych enzymów z ludzkich tkanek utrudniały ich wykorzystanie w badaniach z dobrze zdefiniowanymi systemami metabolizmu leków in vitro. Z tego powodu preparaty mikrosomalne z wieloma enzymami są często wykorzystywane do wyjaśnienia losu utleniania leków i innych ksenobiotyków. Zaletą naszych rekombinowanych preparatów mikrosomalnych jest aktywność pojedynczego izozymu cytochromu P450.

Enzymy cytochromu P450

Cytochromy P450 są członkami nadrodziny monooksygenaz, które katalizują oksydacyjny metabolizm ksenobiotyków, początkowy etap biotransformacji i eliminacji szerokiej gamy leków i zanieczyszczeń środowiska. Enzymy P450 są zlokalizowane głównie w retikulum endoplazmatycznym tkanki wątroby.

Enzymy cytochromu P450

Mikrosomy: Mikrosomy P450 ekspresjonowane w drożdżach

Użycie eukariotycznego, drożdżowego gospodarza pozwala na wydajną ekspresję aktywnego izozymu z dokładniejszą modyfikacją potranslacyjną. Cerosomy są przygotowywane z Saccharomyces cervisiae wyrażających ludzki izozym cytochromu P450 oraz ludzką reduktazę NADPH i cytochrom b5 w niektórych preparatach.

System eukariotyczny zapewnia system izozymów o następujących zaletach:

• Rekombinowany izozym naśladuje aktywny, natywny ludzki enzym
• Wyższa aktywność specyficzna i lepszy stosunek sygnału do szumu (Rysunek 2)
• Stałe i powtarzalne wyniki

Rysunek 2. Aktywność specyficzna określona przez produkt fluorescencyjny wytworzony ze specyficznego dla enzymu niefluorescencyjnego substratu po inkubacji z cytochromem P450. Emisja fluorescencyjna w funkcji czasu daje aktywność na mg białka.

Izozymy cytochromu P450 Cerosomes są dostarczane w roztworze zawierającym 50 mM fosforan potasu, pH 7,4, 5% glicerol, 1 mM EDTA i 1 mM PMSF.

Reduktaza cytochromowa i cytochrom b₅

Mechanizm oksydacyjny układu cytochromu P450 wymaga systemu transportu elektronów białek do wspomagania katalizy. Reduktaza cytochromu P450 (NADP) jest koeksprymowana ze wszystkimi naszymi preparatami rekombinowanego cytochromu P450. Reduktaza cytochromu P450 katalizuje redukcję monooksygenaz zależnych od hemetiolanu, takich jak EC 1.14.14.1 (nieokreślone monooksygenazy ksenobiotyczne2) i jest częścią mikrosomalnego układu hydroksylującego. Reduktaza ta jest flawoproteiną zawierającą FMN i FAD. Redukuje ona również cytochrom b₅ i cytochrom c.

Cytochrom b₅ jest flawoproteiną o masie 15 kDa związaną z błoną, zdolną do zwiększania potencjału redoks układu oksydacyjnego P450.