Porównanie ilościowych testów biologicznych na żywotność: Ocena metod MTT, alamarBlue^™ i Guava^® ViaCount^®

Krista McCutcheon, David Fei

Department of Analytical Sciences, Genentech Inc., South San Francisco, CA 94080-4990

Abstrakt

Testy żywotności są kluczowymi narzędziami w rozwoju wielu leków, w szczególności środków cytotoksycznych. Aby jak najlepiej scharakteryzować potencjalne związki, testy żywotności muszą być w stanie w sposób powtarzalny i dokładny raportować niewielkie procentowe zmiany żywotności, zapewniać statystycznie istotną kwantyfikację aktywności biologicznej i uwzględniać zmiany liczby komórek podczas testu. Analiza interferencji liczby komórek w testach żywotności MTT, alamarBlue™ i Guava^® ViaCount^® została przeprowadzona podczas opracowywania ilościowego testu ligacji CD40. Testy MTT i alamarBlue wykazały znacząco duże różnice statystyczne w pomiarach żywotności z powodu zmian w liczbie komórek. Łatwość użycia i wysoka odtwarzalność systemu ViaCount^® Guava^® zapewnia znaczącą przewagę nad obecnymi testami żywotności lub cytotoksyczności, w których zmiana liczby komórek może być problematyczna.

Wprowadzenie

Badanie cytotoksycznych środków terapeutycznych do leczenia komórek złośliwych lub innych zaburzeń proliferacji komórek jest bardzo aktywnym obszarem rozwoju leków. Testy żywotności, które mają moc statystyczną do ilościowego określania aktywności biologicznej, różnicowania siły działania związków i wskazywania stabilności, są najbardziej wartościowe. W tym celu wymagany jest czuły, powtarzalny, dokładny i zależny od dawki test komórkowy.

Obecnie stosuje się szereg różnych metod pomiaru żywotności komórek za pomocą pośrednich środków proliferacji i metabolizmu (np, barwniki tetrazolowe, takie jak MTT¹, ³[H]-tymidyna lub wychwyt BrdU² oraz alamarBlue³). Zarówno MTT, jak i alamarBlue mogą być przeprowadzane w 96-dołkowym, wysokowydajnym formacie i były stosowane w ilościowych testach cytotoksyczności.^1,3 Krytycznym założeniem stosowanym w pośrednich testach żywotności jest to, że liczba komórek zmniejszy się w powtarzalny sposób, odwrotnie i liniowo proporcjonalnie do dawki leku. Założenie to nie sprawdza się w przypadkach, gdy liczba komórek jest bardzo zmienna w czasie testu. Na przykład: jeśli niewielka liczba reagujących komórek jest maskowana przez większość proliferujących komórek; jeśli lek wpływa na agregację lub adhezję komórek (właściwości, o których wiadomo, że pośrednio wpływają na wzrost komórek); jeśli lek ma nieliniowy wpływ na liczbę komórek (np. powodując apoptozę lub zmieniając cykl komórkowy); lub jeśli docelowa linia komórkowa ma nieregularne właściwości wzrostu. Zmiana docelowych linii komórkowych lub uzyskanie oddzielnych danych dotyczących liczby komórek (np. przy użyciu testów białkowych, liczników kulkowych, kulek TruCount^™ lub hemocytometru) dla każdego dołka w teście często nie jest możliwe. Guava^® ViaCount^® oferuje unikalną alternatywę dla pomiaru żywotności, zliczając zarówno żywotne, jak i nieżywotne populacje komórek, w tym samym czasie, w jednej próbce. Podwójne znakowanie za pomocą dwóch barwników o różnych długościach fali fluorescencyjnej i przepuszczalności błony służy do rozróżnienia żywotnych i nieżywotnych populacji komórek. Jeden barwnik, PM2 (przepuszczalny dla wszystkich komórek) i drugi, PM1 (przepuszczalny tylko dla komórek z uszkodzoną błoną komórkową) umożliwiają wyrażenie danych dotyczących żywotności jako procent całkowitej liczby komórek w każdym dołku próbki. Korzystanie z Guava ViaCount, bezpośredniego pomiaru komórek nieżywotnych i normalizacji każdego punktu danych do całkowitej liczby komórek, koryguje zmienność między dołkami wprowadzoną przez liczbę komórek, poprawiając precyzję wewnątrz i między testami.

Zgłaszamy wpływ zakłóceń liczby komórek na testy MTT, alamarBlue i Guava^® ViaCount^®, mierzony podczas opracowywania ilościowego testu biologicznego dla humanizowanego przeciwciała monoklonalnego skierowanego przeciwko ludzkiemu CD40. Na złośliwych komórkach B ligacja CD40 może skutkować bezpośrednim zahamowaniem wzrostu komórek z apoptozą lub bez niej. Wynik i zakres aktywacji CD40 na komórkach jest złożony i może być regulowany przez fenotyp komórki, siłę sygnału CD40 i obecność kofaktorów.^4-6 Zarówno plejotropowa aktywność leku anty-CD40, jak i nieregularne właściwości wzrostu złośliwej linii komórek B stosowanej w testach przyczyniły się do zakłócenia liczby komórek w testach MTT i alamarBlue. Pokazujemy, w jaki sposób zdolność testu Guava^® ViaCount^® do normalizacji żywotności do liczby komórek zapewniła znaczną poprawę zmienności testu biologicznego monoklonalnego anty-CD40. Względna łatwość testu i nasze wyniki statystyczne sugerują, że test żywotności wykorzystujący Guava PCA i odczynnik Guava^® ViaCount^® może zapewnić znaczną przewagę nad innymi testami biologicznymi w obecnym użyciu, szczególnie w przypadkach, w których liczba komórek wewnątrz i między testami stanowi problem.

Materiały i metody

Odczynniki

Humanizowane przeciwciało monoklonalne anty-CD40 (IgG1) jest odczynnikiem firmy Genentech (South San Francisco, CA, USA). Ludzkie IgG1κ otrzymano od Sigma (St. Louis, MO, USA). Anty-ludzki Fcγ, stosowany do sieciowania humanizowanych przeciwciał do płytek hodowlanych, uzyskano od Jackson ImmunoResearch (Westgrove, PA, USA). Koniugat koziej antyludzkiej IgG-FITC, używany do analizy FACS, został zakupiony od BD PharMingen (San Diego, CA, USA). Odczynnik Guava ViaCount został zakupiony od Guava Technologies (Hayward, CA, USA), odczynnik MTT został zakupiony od ATCC (Rockville, MD, USA), a alamarBlue został zakupiony od Trek Diagnostic Systems, (Westlake, OH, USA).

Hodowla komórkowa i charakterystyka linii komórkowej Raji

Ludzką linię komórkową Raji uzyskano z ATCC (Rockville, MD, USA) i hodowano w warunkach pożywki zalecanych przez ATCC z dodatkiem 100 µg/ml penicyliny/streptomycyny. Komórki analizowano pod kątem jednorodności i jednolitości ekspresji CD40 za pomocą cytometrii przepływowej. Milion komórek w podłożu hodowlanym odwirowano przy 1200 x g i ponownie zawieszono w 0,25 ml buforu blokującego (1% BSA, PBS) na 1 godzinę na lodzie. Usunięto bufor blokujący i dodano 0,25 ml 10 µg/ml przeciwciała monoklonalnego anty-CD40 lub dopasowanej izotypowo ludzkiej IgG1κ w buforze blokującym na 1 godzinę w temperaturze otoczenia. Komórki przepłukano 3 razy w PBS, a następnie dodano rozcieńczenie 1:10 koziej antyludzkiej IgG-FITC w buforze blokowym na 30 minut w temperaturze otoczenia. Zabarwione komórki płukano trzykrotnie w PBS, ponownie zawieszano w 0,4 ml PBS i analizowano za pomocą cytometrii przepływowej na BD FACSCaliber (Becton Dickinson, San Jose, CA).

Morfologię komórek badano pod odwróconym mikroskopem świetlnym Nikon Diaphot 200, przy użyciu obiektywu Phase I, DL 40x.

Testy żywotności komórek

Seria rozcieńczeń przeciwciała monoklonalnego anty-CD40 została usieciowana na płytkach o wysokim wiązaniu białka poprzez stały region łańcucha ciężkiego. Niezwiązane przeciwciało monoklonalne anty-CD40 usunięto przez płukanie, a do każdej studzienki dodano 50 000 komórek Raji. Po 72 godzinach komórki w każdej studzience zostały wymieszane, a podwielokrotności zostały usunięte w celu barwienia odczynnikami MTT, alamarBlue lub Guava ViaCount.

Płytki Costar o wysokim wiązaniu białek, 96-dołkowe, zostały pokryte 0.1 mL, 30 µg/mL, kozim anty-ludzkim Fcγ w 50 mM wodorowęglanie sodu, pH 9,6, przez noc w nawilżonym 5% CO₂, 37 °C inkubatorze. Niezwiązany kozi antyludzki Fcγ usunięto za pomocą dwóch płukań 0,2 ml przy użyciu sterylnego PBS. Pokryte płytki blokowano za pomocą 0,3 ml, 0,5% BSA, PBS przez 1 godzinę w temperaturze otoczenia. Roztwór blokujący usunięto, a płytkę przepłukano raz 0,3 ml PBS. Przygotowano serię rozcieńczeń przeciwciała monoklonalnego anty-CD40 (od 4 do 0,002 µg/ml) w PBS i naniesiono 0,1 ml na płytkę delikatnie mieszając przez 4 godziny w temperaturze otoczenia. Niezwiązane przeciwciało usunięto, a płytkę przemyto dwukrotnie 0,2 ml PBS. Komórki Raji wysiano do pożywki wzrostowej (RPMI 1640, 10% FBS, 2 mM L-glutaminy, 1,5 g/L wodorowęglanu sodu, 4.5 g/l glukozy, 10 mM HEPES, 1 mM pirogronianu sodu i 100 µg/ml penicyliny/streptomycyny) w ilości mniejszej niż 1 x 10⁶ komórek/ml i hodowano w nawilżonym 5% CO₂, 37°C inkubatorze przez 24 godziny przed wykonaniem testów. Komórki Raji rosły w odwracalnych agregatach komórkowych i aby utrzymać reaktywność w teście, komórki były rutynowo dzielone, zanim gęstość przekroczyła 1 x 10⁶ komórek/ml. W dniu testu przygotowywano zawiesinę 0,25 x 10⁶ komórek/mL komórek Raji w pożywce testowej (pożywka wzrostowa, zawierająca 2% FBS) i dodawano 0,2 ml do każdej studzienki, aby uzyskać 0,5 x 10⁵ komórek/studzienkę. Konieczne było badanie komórek w pożywce o obniżonej zawartości surowicy (1-5%). Komórki badane w 10% surowicy nie reagowały dobrze w teście. Komórki są inkubowane z przeciwciałem monoklonalnym anty-CD40 usieciowanym Fc przez 72 godziny w nawilżonym 5% CO₂, 37°C inkubatorze. Komórki Raji zazwyczaj rosną w zawiesinie. Jednakże, aby upewnić się, że badamy populację komórek reprezentatywną dla każdego dołka, pipetowaliśmy w górę i w dół w dołkach 10 razy przed przeniesieniem komórek do testów żywotności.

Testy alamarBlue przeprowadzono dodając 50 µl alamarBlue do 50-100 µl komórek na 2-16 godzin w nawilżonym 5% CO₂, 37 °C inkubatorze. Fluorescencję mierzono przy długości fali wzbudzenia 530 nm i długości fali emisji 590 nm. alamarBlue działa jako wskaźnik utleniania-redukcji, który fluoryzuje w odpowiedzi na chemiczną redukcję pożywki wzrostowej wynikającą ze wzrostu komórek. Sygnał jest określany ilościowo przy 590 nm za pomocą fluorometru.

Testy MTT przeprowadzono zgodnie z opisem w instrukcji produktu przy użyciu 50 µL komórek. Po 6 godzinach w nawilżonym 5% CO₂, 37 °C inkubatorze, dodano detergent w RT i zmierzono sygnał od 6 do 24 godzin. Żółta sól tetrazolowa (MTT) jest redukowana w metabolicznie aktywnych komórkach, tworząc nierozpuszczalne fioletowe kryształy formazanu, które są rozpuszczane przez detergent. Kolor jest następnie oznaczany ilościowo metodą spektrofotometryczną (570 nm).

Testy Guava^® ViaCount^® zostały przeprowadzone poprzez przeniesienie 50 µL komórek w pożywce do mikropłytek zawierających 150 µL odczynnika Guava^® ViaCount^®. Po inkubacji przez 5 minut w temperaturze pokojowej w ciemności, wykonano pomiary żywotności i liczby komórek za pomocą Guava^® Personal Cell Analysis System (PCA^™). Dane dotyczące żywotności wyrażono jako procent całkowitej liczby komórek.

Analiza danych

Procentowa żywotność (Guava^® ViaCount^®) lub gęstość optyczna (alamar.) lub gęstość optyczna (alamarBlue lub MTT) zostały wykreślone na osi y względem logarytmicznej skali stężenia przeciwciała monoklonalnego anty-CD40 (µg/ml) na osi x. Oprogramowanie Kaleidograph zostało użyte do dopasowania 4-parametrowej krzywej logistycznej, zgodnie z równaniem:

y = [(m₁-m₄)/ (1+(m₀/m₃)^m2)] + m₄

gdzie m₁= szacowana odpowiedź przy dawce zerowej (minimalnej); m₂= parametr krzywizny; m₃= odpowiedź przy 50% maksymalnej odpowiedzi (IC₅₀); i m₄= szacowana odpowiedź przy nieskończonej dawce (maksimum).

Wyniki

Zaobserwowano, że przeciwciało monoklonalne anty-CD40 ma wieloraki wpływ na linię komórek Raji. Oprócz zmniejszenia żywotności komórek, zaobserwowano również zależny od dawki wpływ na liczbę komórek, homotypową agregację i rozprzestrzenianie się komórek (rysunek 1). Każdy efekt miał swoją własną zależność od dawki i przebieg czasowy aktywności w odpowiedzi na monoklonalne anty-CD40. Stwierdzono, że udział liczby komórek w zmienności testu jest znaczący, a normalizacja danych dotyczących żywotności do liczby komórek była niezbędna do opracowania powtarzalnego testu. Dane dotyczące liczby komórek (Rysunek 1A) słabo pasowały do 4-parametrowej krzywej (termin korelacji, R = 0,88), a współczynnik zmienności (CV) poszczególnych punktów w całym zakresie stężeń przeciwciała anty-CD40 był niedopuszczalnie wysoki (8-30%).

Rysunek 1. Plejotropowe działanie humanizowanego przeciwciała monoklonalnego anty-CD40 na komórki Raji. Komórki Raji inkubowano z humanizowanym przeciwciałem monoklonalnym anty-CD40 przez 72 godziny. Próbki oceniano za pomocą Guava^® ViaCount^® A) lub badano pod odwróconym mikroskopem przy 40-krotnym powiększeniu (B, pokazano 1 μg/ml przeciwciała anty-CD40). Zilustrowano wpływ leku na liczbę komórek, agregację komórek i rozprzestrzenianie się komórek.

Porównanie typowych wyników testów alamarBlue, MTT i Guava^® ViaCount^® przedstawiono na rysunku 2. Na krzywych dawka-odpowiedź zmienność wewnątrz testu wynosiła 3-57% w teście alamarBlue, 8-30% w teście MTT i 1-5% w teście Guava^® ViaCount^® . Ponadto testy alamarBlue i MTT w niektórych dniach nie były w stanie wykryć żadnych zmian w żywotności. Guava^® ViaCount^® wykazał zmienność między testami na poziomie 4-12% w ciągu 10 testów.

Rysunek 2. Zależne od dawki hamowanie żywotności komórek Raji przez humanizowane przeciwciało monoklonalne anty-CD40. Komórki Raji inkubowano z humanizowanym przeciwciałem monoklonalnym anty-CD40 przez 72 godziny. AlamarBlue (A), MTT (B) lub Guava^® ViaCount^® (C), z duplikatów próbek na jednej płytce, pokazując zmienność w teście.

Test żywotności humanizowanego przeciwciała monoklonalnego anty-CD40 został zakwalifikowany przy użyciu Guava^® ViaCount^®. Na komórkach Raji opracowano krzywą hamowania o czułości ponad 1,5 jednostki logarytmicznej w zakresie od 0,01 do 2 µg/ml przeciwciała monoklonalnego anty-CD40. Średnie 50% stężenie hamujące z dziesięciu niezależnych testów, z komórkami z pasaży od 10 do 22, wynosiło 0,21 ± 0,03 µg/ml (ze współczynnikiem wariancji 12,3%). Precyzję oceniano poprzez utworzenie trzech kontroli w punktach wysokiej (2 µg/ml), średniej (0,3 µg/ml) i niskiej (0,1 µg/ml) dawki krzywej hamowania. Z 12 powtórzeń na płytce, procentowa żywotność niskich, średnich i wysokich kontroli wynosiła odpowiednio 57,8 ± 2,26% (CV = 3,9%), 45,2 ± 4,53% (CV = 10,4%) i 32,8 ± 1,97 (CV = 6,0%). W teście Guava^® ViaCount^® uzyskano wewnątrzpróbkowe CV na poziomie 2,9%, gdy średnia próbka kontrolna była mierzona wielokrotnie sześć razy. Stabilność sygnału Guava^® ViaCount^® testowano przy użyciu rzędu 12 średnich próbek kontrolnych mierzonych po 10 minutach i jednej godzinie. Współczynnik zmienności między próbkami 10-minutowymi i 1-godzinnymi wynosił mniej niż 4,5%, a pomiary nie wykazywały dryftu zależnego od czasu. Przy użyciu całej 96-dołkowej płytki zmienność wewnątrz płytki, określona przy użyciu średniej dawki IC₅₀, była mniejsza niż 5%. Dokładność została przetestowana poprzez pomiar odzysku próbki przygotowanej przy 75% średniej dawki IC₅₀. Procent żywotności próbki odzysku porównano z 75% wartości IC₅₀ uzyskanej z krzywej dawka-odpowiedź w tym samym teście. Procentowa żywotność próbki odzysku wynosiła 103% oczekiwanej wartości.

Dyskusja

Linia komórek Raji stosowana w tych testach wydawała się jednorodna w analizie FACS: parametry rozproszenia bocznego i rozproszenia do przodu wykazały morfologicznie podobną populację; 100% żywych komórek było konsekwentnie CD40+; a poziom ekspresji CD40 był jednolity (nie pokazano). Pomimo tej pozornej jednorodności komórek, zaobserwowano, że przeciwciało monoklonalne anty-CD40 nie tylko zmniejsza żywotność komórek, ale także ma zależny od dawki i nieregularny wpływ na liczbę i morfologię komórek. Zmiany liczby komórek wejściowych i mediów testowych, podklonowanie linii komórkowej i synchronizacja cyklu komórkowego nie były w stanie poprawić zmienności testu. Jako kontrola, oczyszczona ludzka IgG1κ została przetestowana w zakresie dawek testu i nie wykazała żadnego wpływu na komórki Raji. Obserwowane zmiany morfologiczne w komórkach Raji w odpowiedzi na przeciwciało anty-CD40 w naszych testach zostały zgłoszone w powiązanych badaniach.^7-13

Uznano, że sieciowanie przeciwciała monoklonalnego anty-CD40 przez Fc optymalizuje sygnał hamujący CD40 na powierzchni komórki.^14,15 Badanie dołków pod mikroskopem nie wykazało dowodów na to, że zależny od dawki spadek liczby komórek lub ich żywotności mierzony w tych testach był spowodowany proporcjonalnym wzrostem liczby komórek nieodwracalnie wychwytywanych przez płaszcz przeciwciała monoklonalnego anty-CD40. Zbadano mechanizm leżący u podstaw zmniejszonej liczby komórek w tym teście, ale nasze dane nie były jednoznaczne. W innych badaniach zaobserwowano, że przeciwciało anty-CD40 hamuje wzrost komórek, z apoptozą lub bez niej.^4-6

Analiza cytometrii przepływowej w celu oceny żywotności i określenia chemioterapeutycznych wartości IC₅₀ na ludzkich białaczkowych liniach komórkowych została wcześniej uznana za porównywalną z testem MTT.¹⁶ Zdolność Guava^® PCA do wykorzystania mniejszych objętości próbek, mniejszej liczby zdarzeń i 10-krotnie mniejszej liczby komórek niż w przypadku tradycyjnych cytometrów przepływowych jest zaletą, gdy cenna jest objętość i czas hodowli komórek. Ponadto stwierdziliśmy, że normalizacja żywotności do liczby komórek zwiększyła pewność oznaczeń IC₅₀. Normalizacja ta została ułatwiona dzięki oprogramowaniu Guava^® ViaCount^®, które podaje bezwzględną liczbę komórek i stężenie dla wszystkich próbek. W tym celu metoda Guava^® ViaCount^® jest znacznie prostsza niż inne metody, takie jak MTT lub alamarBlue, które wymagają drugiego testu do normalizacji danych do liczby komórek (np,

W przypadku zastosowania w systemie Guava PCA-96, test Guava^® ViaCount^® umożliwia wysokowydajne pozyskiwanie danych bezpośrednio z 96-dołkowych płytek, tworząc prosty sposób badania związków lub przeciwciał pod kątem cytotoksyczności. Nasze dane potwierdzają, że test Guava ViaCount jest w stanie wygenerować czułe, powtarzalne i dokładne ilościowe oznaczenie aktywności biologicznej przeciwciała monoklonalnego anty-CD40. Test ten będzie cennym narzędziem w opracowywaniu testów mierzących siłę działania i stabilność leku. Inne kombinacje lek-linia komórkowa mogą skorzystać z tego typu analizy, szczególnie gdy istnieje potrzeba wyizolowania aktywności leku na żywotność komórek z jego nieliniowego wpływu na liczbę komórek.

Podsumowując:

• Guava^® ViaCount^® jest znacznie bardziej powtarzalny niż testy MTT i alamarBlue, szczególnie gdy liczba komórek zmienia się podczas eksperymentu.
• Bezpośrednie pomiary bezwzględnej liczby komórek sprawiają, że Guava^® ViaCount^® jest prostszy w użyciu niż MTT lub alamarBlue, które wymagają drugiego testu liczenia komórek w połączeniu.

Podziękowania

Dziękujemy Lori O'Connel i Leonardowi Presta za opracowanie humanizowanego przeciwciała anty-CD40 wykorzystanego w tym badaniu. Dziękujemy również Eleanor Canova-Davis i Maureen Beresini za pomocne komentarze i porady.