Wielokolorowa cytometria przepływowa: Wskazówki i narzędzia do tworzenia paneli cytometrii przepływowej

Cytometria przepływowa jest potężną techniką charakteryzowania i/lub sortowania heterogenicznych populacji zawieszonych komórek na podstawie ich właściwości fizycznych i fluorescencyjnych.  Wraz z rozwojem nowych fluorochromów, które nadają się do cytometrii przepływowej, zainteresowanie wielokolorową cytometrią przepływową ogromnie wzrosło. Czytaj dalej, aby dowiedzieć się więcej o wyzwaniach związanych z wielokolorową cytometrią przepływową, krokach tworzenia wielokolorowego panelu cytometrii przepływowej, barwnikach tandemowych i narzędziach do projektowania testów wielokolorowych.

• Co to jest wielokolorowa cytometria przepływowa?
• Wyzwania związane z wielokolorową cytometrią przepływową
• Jak zbudować panel wielokolorowej cytometrii przepływowej
• Użycie barwników tandemowych

Co to jest wielokolorowa cytometria przepływowa?

Wielokolorowa cytometria przepływowa to szybko rozwijająca się technologia, która wykorzystuje wiele markerów fluorescencyjnych do identyfikacji i charakteryzowania subpopulacji komórkowych będących przedmiotem zainteresowania.Poprawia ona wydajność eksperymentów cytometrii przepływowej, wymagając mniejszej liczby próbek i mniejszych objętości próbek. Zwiększenie przepustowości próbek może pozwolić na badanie skuteczności leków w stosunku do różnych typów komórek i analizowanie różnych interakcji białko-białko. Chociaż mniejsze panele cytometrii przepływowej minimalizują złożoność rozlania i kompensacji instrumentu, bardziej wyrafinowane i zaawansowane cytometry przepływowe pozwoliły na jednoczesne badanie większej liczby parametrów i udzielenie odpowiedzi na bardziej skomplikowane pytania.

Wielokolorowa cytometria przepływowa, znana również jako multipleksowa cytometria przepływowa, stała się niezbędnym narzędziem do badania układu odpornościowego w badaniach nad zdrowiem i chorobami, ponieważ pozwala badaczom uzyskać wieloparametryczne dane z mniejszych ilości próbek. Proces ten może być jednak skomplikowany ze względu na znaczne różnice w wydajności różnych cytometrów przepływowych. W związku z tym należy systematycznie parować fluorofory w każdym panelu wielokolorowym w celu uruchomienia na wybranym cytometrze przepływowym.  Dane uzyskane w eksperymentach wielokolorowej cytometrii przepływowej również wymagają starannej analizy.

Wyzwania związane z wielokolorową cytometrią przepływową

Chociaż multipleksowanie w cytometrii przepływowej oferuje szereg korzyści w porównaniu z użyciem tylko jednego pierwotnie sprzężonego przeciwciała na próbkę, wielokolorowa cytometria przepływowa ma swoje własne wyzwania.

Wyzwania te obejmują:

• Wymaga szczegółowego projektu eksperymentalnego, w tym wyboru fluorochromów i rozważań dotyczących celu.
• Projekt panelu wielokolorowego wymaga starannego zestawienia fluorochromów o nienakładających się widmach.
  • Obejmuje to również potrzebę kompensacji i wszelkich korekt "spillover" w celu uzyskania dokładnych, wiarygodnych i powtarzalnych danych.

  Jak zbudować wielokolorowy panel do cytometrii przepływowej

  .Aby zbudować niezawodny panel wielokolorowej cytometrii przepływowej i uniknąć problemów z nakładaniem się widm i utratą rozdzielczości, należy zaprojektować panel przy użyciu macierzy rozprzestrzeniania się wycieków (SSM) wygenerowanej z cytometru przepływowego, który ma być używany. SSM służy do zapewnienia, że fluorochromy o znacznym nakładaniu się widma nie łączą się z markerami wyrażonymi na tym samym typie komórek lub pomagają w wykrywaniu markerów, które są obecne na bardzo niskich poziomach. SSM pozwala również upewnić się, że przyciemnione kolory są używane dla markerów o wysokiej ekspresji i odwrotnie. 

  Zwykle badacze polegają na własnych doświadczeniach dotyczących danych markerów i oczekiwanej gęstości antygenu. Chociaż producenci mogą podawać powinowactwa przeciwciał na swoich stronach internetowych, najlepszą praktyką jest testowanie i weryfikowanie wiązania przeciwciał każdej nowej partii, która jest kupowana. Po przetestowaniu przeciwciał, pełny panel wielokolorowej cytometrii przepływowej powinien zostać przetestowany na zdrowych komórkach.

  Kroki w budowaniu panelu wielokolorowej cytometrii przepływowej

  Projektowanie i budowanie panelu wielokolorowej cytometrii przepływowej jest jednym z najtrudniejszych procesów podczas badań z użyciem testów wielokolorowej cytometrii przepływowej. Obejmuje on następujące kroki:

  • Starannie wybierz docelowe antygeny.
    
  • Potwierdź znajomość konfiguracji używanego instrumentu (zarówno lasera, jak i filtrów).
    • Profil wybranych fluorochromów powinien pasować do konfiguracji optycznej cytometru przepływowego.
  • Przeprowadź przegląd literatury lub użyj przeglądarek widm online, aby zbadać wszelkie nakładające się widma.
  • Optymalizuj fluorofory tak szeroko, jak to możliwe, w różnych laserach i filtrach, aby zmniejszyć wszelkie możliwe zakłócenia.
  • Rozważ przesunięcie Stokesa dla każdego fluorochromu używanego w panelu wielokolorowym.
  • Chociaż fluorofory o nienakładających się widmach emisji są idealne, można zastosować kontrole kompensacyjne cytometrii przepływowej lub kulki kontrolne, aby upewnić się, że każde wykryte światło jest przypisane do właściwego fluoroforu.
  • Wybierz i zarezerwuj najjaśniejszy fluorochrom dla najsłabszego przeciwciała i odwrotnie.
  • Przejrzyj literaturę, aby zbadać populacje komórek wyrażające określone cele zainteresowania i stopień ekspresji każdego z celów.
  • Sprawdź, czy do wygenerowania sygnału wymagana jest określona linia komórkowa lub stymulacja komórek.
  • Przejrzyj literaturę, aby zbadać, które subpopulacje komórek współeksprymują te same markery.
  • Wybierz odpowiednie kontrole.
    • Nie wybarwione komórki mogą być użyte jako negatywna populacja kontrolna.
  • Zoptymalizuj każde stężenie przeciwciała, które ma być użyte.
    • Zmierz stężenie, które generuje największy rozrzut przy najmniejszej ilości tła.
  • Rozważ fotostabilność każdego fluoroforu sprzężonego z przeciwciałem.
  • Zdecyduj, który klon działa najlepiej, jeśli dostępnych jest wiele klonów przeciwciał monoklonalnych.
  • Stain komórki z pełnym panelem cytometrii przepływowej i oceń. W razie potrzeby wprowadź zmiany.
  • Zawsze dołączaj barwnik żywotności komórek do panelu, aby ocenić śmierć komórek w trakcie eksperymentu.

  Używanie barwników tandemowych

  Używanie barwników tandemowych jest powszechne w analizie cytometrii przepływowej. Podlegają one jednak degradacji z powodu światłoczułości lub długotrwałego przechowywania. Prowadzi to do zmniejszenia transferu energii rezonansu fluorescencji (FRET). Prowadzi to również do zwiększonego sygnału z fluoroforów akceptora i donora, co wymaga zwiększonej kompensacji i może generować niewiarygodne dane.

  Niektóre barwniki tandemowe są również wrażliwe na utrwalanie. Możliwe jest również, że niektóre z tych barwników mogą wiązać się niespecyficznie z niektórymi typami komórek, takimi jak barwniki PE-Cy5, PerCP-Cy5 i APC-Cy7, które wiążą się z monocytami i makrofagami, częściowo z powodu ich wiązania z ludzkim receptorem FC CD64 o wysokim powinowactwie.