Test ELISpot: Funkcjonalna immunologia komórkowa
Co to jest test ELISpot?
W optymalnych warunkach test ELISpot (enzyme-linked immunosorbent spot) umożliwia wizualizację wielu produktów wydzielniczych z pojedynczej reagującej komórki. W ten sposób ELISpot dostarcza zarówno informacji jakościowych (rodzaj białka immunologicznego), jak i ilościowych (liczba reagujących komórek). Dzięki niezrównanej czułości tego testu, analiza częstotliwości rzadkich populacji komórek (np. odpowiedzi specyficznych dla antygenu), która wcześniej nie była możliwa, jest teraz stosunkowo łatwa. Niedawne ulepszenia w projektowaniu mikropłytek wielodołkowych, w tym zastosowanie membran o zmniejszonej fluorescencji tła, wzmocniły powszechne zastosowanie testów Elispot. Biorąc pod uwagę czułość testu, łatwość użycia i koszt, platforma Elispot jest prawdopodobnie najlepszym wyborem do opracowania wielofunkcyjnych testów komórek T dla społeczności badawczych, terapeutycznych i diagnostycznych.
Odpowiedź immunologiczna i Elispot - konieczność jest matką innowacji
Precyzyjna regulacja funkcji efektorowych ma kluczowe znaczenie dla uzyskania silnej, ale specyficznej odpowiedzi immunologicznej. Limfocyty T zapewniają ramy dla tego procesu, doskonale organizując obronę organizmu przed infekcjami i rakiem. Osiąga się to poprzez wysoce selektywne zaangażowanie i aktywację linii komórek efektorowych specyficznych dla antygenu. W zależności od siły i charakteru bodźców, można wywołać szeroki zakres funkcji efektorowych, w tym aktywność cytolityczną, wydzielanie wielu cytokin i innych bioaktywnych cząsteczek, proliferację i selektywne naprowadzanie na miejsca infekcji. Ponieważ te limfocyty T i ich odpowiedzi stanowią prawdziwe korelaty wyników klinicznych, ostatecznym celem w diagnostyce immunologicznej była niezawodna identyfikacja tej niewielkiej frakcji reagentów, zakwalifikowanie ich sposobu (sposobów) działania i dokładne określenie stopnia odpowiedzi. Chociaż żaden test nie może mierzyć wszystkich istotnych parametrów jednocześnie, ELISpot oferuje wielowymiarową, ilościową ocenę funkcji efektorowych na poziomie pojedynczej komórki z doskonałą czułością i rozdzielczością.
Opracowany w 1983 r. test ELISpot reprezentuje konwergencję opartych na płytkach enzymatycznych testów immunosorbcyjnych (ELISA) z opartymi na membranach technologiami Western blot, umożliwiając wykrywanie wydzielanych analitów na poziomie pojedynczej komórki. Membrany oferują znacznie lepszą charakterystykę wiązania w porównaniu ze standardowymi powierzchniami polistyrenowymi. Chociaż istnieje wiele opcji, większość Elispotów jest obecnie wykonywana na płytkach membranowych z polifluorku winylidenu (PVDF). Wiązanie przeciwciała wychwytującego (Ab) jest regulowane przez oddziaływania hydrofobowe między aminokwasami, takimi jak fenyloalanina lub leucyna, a PVDF; to powiązanie jest znacznie silniejsze niż oddziaływania elektrostatyczne na powierzchniach nitrocelulozowych.3,4 Silniejsze interakcje wiążące przekładają się na większą gęstość Ab na powierzchni membrany, co skutkuje lepiej zdefiniowanymi plamami.4 Ponieważ odczyt dla ELISpot to "plamki/dołek", biały kolor membrany PVDF stanowi idealne tło do wykrywania i analizy plamek. Format mikropłytki oferuje ponadto większą przepustowość i jest podatny na automatyzację; więcej próbek, więcej bodźców lub większa liczba różnych cytokin może być oznaczana jednocześnie w sąsiednich dołkach.
Początkowo opracowany do oznaczania liczby komórek B wydzielających przeciwciała specyficzne dla antygenu1,2, ELISpot został dostosowany do wielu zadań, z których najważniejszym jest ilościowe oznaczanie odpowiedzi cytokinowej specyficznej dla antygenu (rysunek 1). W standardowym teście specyficzne dla cytokin Abs są unieruchamiane na 96-dołkowych płytkach z membraną. Następnie komórki (zwykle całkowite jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) lub oczyszczone podgrupy) są wysiewane w obecności lub przy braku czynników stymulujących. Z czasem aktywowane komórki zaczynają wydzielać cytokiny, które wiążą się z wychwytującym Ab w bezpośrednim sąsiedztwie komórki wykazującej ekspresję. Komórki są następnie wypłukiwane, a wykrywanie plamek odbywa się poprzez odkładanie substratu po jednoetapowym (sprzężone enzymatycznie, specyficzne dla cytokin Ab) lub dwuetapowym (biotynylowane Ab/streptawidyna-enzym) procesie wiązania przeciwciał. Po wytworzeniu sygnałów, liczbę plamek można zliczyć ręcznie lub za pomocą czytników plamek opartych na obrazie z towarzyszącym oprogramowaniem analitycznym. Częstotliwość i całkowita liczba komórek reagujących jest określana przez porównanie liczby plamek między dołkami stymulowanymi i nieleczonymi/kontrolnymi.
Niniejszy przegląd podkreśli unikalne cechy wydajności, atrybuty przepływu pracy i korzyści kosztowe, które, rozpatrywane łącznie, wyraźnie identyfikują test ELISpot jako doskonałą platformę do wyjaśniania złożoności leżących u podstaw odpowiedzi immunologicznych. Ponadto przedstawiamy najnowsze postępy związane z tą technologią oraz sposób, w jaki te ulepszenia zapewniają większe korzyści społeczności badawczej, niezależnie od tego, czy koncentrują się one na badaniach mechanistycznych, diagnostyce czy projektowaniu terapeutycznym. Na koniec szczegółowo omówiony zostanie protokół testu, z naciskiem na standardowe najlepsze praktyki i przewodniki rozwiązywania problemów.
Niezrównana moc platformy Elispot do analizy funkcjonalnej komórek T
Złożoność każdej odpowiedzi immunologicznej jest podkreślana przez mnogość parametrów, które mogą wymagać oceny w celu uzyskania jasności co do mechanizmów fizjologicznych leżących u podstaw tego procesu. Chociaż istnieje wiele formatów testów, te najczęściej stosowane w badaniach funkcji efektorowych komórek T ex vivo obejmują cytometrię przepływową, ELISpot, ELISA, multipleksowe tablice koralikowe i ilościową PCR. Chociaż wszystkie mają określone mocne strony i ograniczenia, testy Elispot mają wyraźne zalety, które zostaną podkreślone w poniższej sekcji.
Test ELISpot, podobnie jak oparte na cytometrii przepływowej barwienie cytokin wewnątrzkomórkowych (ICS), bezpośrednio określa częstotliwość komórek T specyficznych dla antygenu (Ag), co stanowi podstawową kompetencję w diagnostyce immunologicznej. Taka zdolność rozdzielcza jest nieosiągalna w przypadku testów opartych na supernatancie, takich jak ELISA lub multipleksowe tablice koralikowe, w których pomiary opierają się na masowej produkcji cytokin przez wszystkie komórki w danym dołku próbki. U pacjentów z ostrym zakażeniem HIV częstotliwość komórek wytwarzających IFNγ w odpowiedzi na powszechne antygeny przypominające (np. TT lub PPD) była porównywalna do zdrowych dawców; jednak wielkość plamki jest dramatycznie zmniejszona5. Wynik ten sugeruje, że funkcja limfocytów T specyficznych dla HIV, a nie liczba komórek, była upośledzona. Podobnie, komórki T niedawno aktywowane in vivo mogą wykazywać zwiększoną produkcję cytokin na komórkę w porównaniu do "starszych" komórek T pamięci6,7. Zdolność do rozróżnienia między pamięcią długoterminową a niedawno aktywowanymi podzbiorami ma wpływ na diagnostykę komórek T w chorobach autoimmunologicznych i przewlekłych infekcjach. Wyniki testów masowych są również zakłócane przez udział sygnału tła z wrodzonego układu odpornościowego. Rozcieńczenie odpowiedzi specyficznej dla Ag powoduje ogólne spłaszczenie sygnału; kwestia ta jest najbardziej istotna dla wykrywania obecności rzadkich populacji, takich jak krążące komórki nowotworowe (CTC) w PBMC lub rozsiane komórki nowotworowe w szpiku kostnym, oba wczesne markery przerzutów8.
Rysunek 1.Przebieg testu ELISpot. (1) Pokryć membranę przeciwciałem wychwytującym. Dodaj komórki odpornościowe i stymuluj. (2) Reagujące komórki wytwarzają cytokiny. Cytokina będąca przedmiotem zainteresowania wiąże się z wychwytującym Ab pod komórką. (3) Przemyć w celu usunięcia komórek. Dodać drugi biotynylowany Ab specyficzny dla cytokin, który wiąże się z kompleksem cytokina-Ab. (4) Dodać koniugat streptawidyna-enzym. (5) Dodać substrat enzymatyczny i rozwinąć. W studzience każda reagująca komórka spowoduje powstanie jednej plamki.
Aby repertuar komórek T był w stanie rozpoznać potencjalnie nieskończoną liczbę czynników infekcyjnych, jednocześnie odróżniając je od siebie, całkowita pula naiwnych komórek zawiera ≥ 1012 unikalnych swoistości receptora komórek T (TCR). W związku z tym, przy braku infekcji, częstotliwość krążących komórek pamięci o swoistości dla dowolnego antygenu jest dość niska, zwykle w zakresie 1:10 000 - 1 000 0009,10. Wykrywanie takich rzadkich zdarzeń może stanowić poważne wyzwanie dla platform opartych na przepływie, gdzie dolna granica czułości wynosi 0,02%11. W porównaniu do ELISpots, próg czułości dla pomiarów cytokin w supernatantach hodowlanych jest dodatkowo zmniejszany przez rozcieńczenie analitu w otaczającym środowisku, absorpcję przez komórki uboczne i degradację enzymatyczną. Natomiast testy ELISpot wykazują próg wykrywalności poniżej 25 komórek T produkujących IFNγ na milion PBMC (0,0025%)12,13; jest to równoznaczne z prawie 10-krotnym wzrostem czułości wykrywania. Wysoka czułość testu ELISpot jest również ważna w badaniach nad alergią, gdzie identyfikacja komórek produkujących cytokiny Th2 o bardzo niskiej częstotliwości ma kluczowe znaczenie zarówno dla monitorowania choroby, jak i rozwoju terapii immunologicznych14. W szczególności, zarówno cytometria przepływowa, jak i platformy ELISA wykazują niewystarczające wykrywanie IL-4, głównego wskaźnika odpowiedzi Th215.
Test ELISpot jest jedną z niewielu technik umożliwiających ilościową analizę funkcji biologicznej pojedynczej komórki (np. uwalnianie cytokin). W przypadku wewnątrzkomórkowego barwienia cytokin (ICS), w którym wykrywanie cytokin następuje przed uwolnieniem, istnieje możliwość uzyskania mylących wyników z powodu modulacji potranslacyjnej przed lub w trakcie procesu wydzielania 16 . Czas trwania testu ICS jest ograniczony przez toksyczność inhibitorów transportu białek, takich jak Brefeldin A lub Momensin. W przypadku ilościowego RT-PCR wykrywanie jest jeszcze bardziej oddalone od rzeczywistej funkcji, ponieważ mierzonym celem jest mRNA. Testy ELISpot są również niezależne od kinetyki wydzielania, co jest istotnym faktem, biorąc pod uwagę niezsynchronizowany charakter puli reagujących limfocytów T. W przypadku ICS wszystkie komórki są zabijane poprzez utrwalenie w określonym czasie. Mediatory odpowiedzi cytolitycznej, takie jak granzym B i perforyna, są przechowywane w granulkach, a następnie uwalniane pod wpływem odpowiednich bodźców17-19. Ze względu na ten unikalny mechanizm regulacyjny, ICS fałszywie zidentyfikuje wszystkie komórki pamięci efektorowej (~20% wszystkich limfocytów T) jako perforynododatnie. Być może większe znaczenie ma test Lysispot, zmodyfikowany test ELISpot zdolny do wyliczenia funkcji efektorowych cytotoksycznych komórek T CD8+ specyficznych dla Ag poprzez bezpośrednią lizę komórek docelowych20. Do czasu opracowania testu Lysispot, ponieważ większość testów cytotoksyczności jest wykonywana na hodowlach masowych21, IFNγ ELISpots były powszechnie stosowane jako korelaty odporności komórkowej CD8+22-24.Zastosowanie Lysispot w badaniach nad HIV ujawniło, że nie wszystkie komórki wytwarzające IFNγ były zdolne do zabijania25. Odkrycie to podkreśla również potrzebę większej wielokrotności wykrywania w testach immunologicznych pojedynczych komórek.
Komórki T występują w szerokim zakresie klas efektorowych, a ekspresja jednego lub więcej z nich może się znacznie różnić w zależności od rodzaju patogenu i statusu immunologicznego pacjenta. Łączne odkrycia w dziedzinie diagnostyki gruźlicy (TB) sugerują, że różnice w sygnaturze cytokin mogą zapewnić wyraźniejsze rozróżnienie między bezobjawowymi utajonymi i aktywnymi formami infekcji. Szybka identyfikacja aktywnych przypadków jest najbardziej krytyczna, ponieważ osoby te stanowią największe zagrożenie dla zdrowia społeczności26-30. Podczas gdy kwantyfikacja oparta na kulkach w supernatantach oferuje analizę wieloparametrową, cierpi ona z powodu ograniczeń wykluczających akceptację jako platformy diagnostycznej dla gruźlicy i innych chorób. W przeciwieństwie do tego, ELISpots są przystosowane do analiz multipleksowych przeprowadzanych jednocześnie (pojedyncza studzienka) lub równolegle. Dobrze ugruntowane dwukolorowe ELISpoty, wykorzystujące zarówno podejście enzymatyczne, jak i fluorescencyjne, są obecnie stosowane w wielu środowiskach badawczych. Fluorescencyjne ELISpoty lub FluoroSpoty oferują znaczące korzyści w porównaniu z formatami kolorymetrycznymi, szczególnie w obszarach multipleksowania i automatycznego wykrywania plamek. Co więcej, ponieważ rozwój plamki nie jest enzymatyczny, intensywność sygnału jest wprost proporcjonalna do ilości analitu w plamce, a zatem znacznie bardziej ilościowa.
Zwiększenie zdolności multipleksowania poza dwa kolory wymaga powierzchni membran o minimalnym fluorescencyjnym sygnale tła. Ze względu na ich wysoce porowatą naturę, powierzchnie membran są bardzo szorstkie.
Z tego powodu rozpraszają światło i wykazują wysokie tło fluorescencji. Podczas gdy membrana PVDF (membrana Immobilon®-P) jest rzekomo lepszą powierzchnią niż nitroceluloza dla FluoroSpots, wariant membrany Immobilon®-FL PVDF został zaprojektowany specjalnie do wykrywania fluorescencji w aplikacjach Western blot i wykazuje sygnał fluorescencji tła, który wynosi prawie 1/100 sygnału standardowej membrany PVDF. Dane pokazujące zastosowanie membrany Immobilon®-FL w dwukolorowych reakcjach IFNγ/IL-2 FluoroSpots przedstawiono na Rysunku 2 (zdjęcia) i Rysunku 5 (strona 6, liczba plamek). Poza multipleksowaniem, FluoroSpots pozwalają na rozróżnienie dwóch jednocześnie mierzonych wyników funkcjonalnych. Multipleksowanie służy również do zmniejszenia wymaganej wielkości próbki. Stale rosnąca dostępność dyskretnych fluorochromów, w połączeniu z wielofunkcyjnym oprzyrządowaniem do obrazowania fluorescencyjnego oraz w pełni zautomatyzowaną akwizycją próbek i analizą danych, zapewnia ramy dla niezrównanej analizy polifunkcjonalnej odpowiedzi komórek T specyficznych dla Ag za pomocą ELISpots.
Rysunek 2.Reprezentatywne obrazy z dwukolorowych testów IFNγ/IL-2 FluoroSpot przeprowadzonych na płytkach Multiscreen® HTS wyposażonych w zoptymalizowaną pod kątem FluoroSpot membranę Immobilon®-FL PVDF. Pula CEF odnosi się do puli peptydów obejmujących epitopy wirusa cytomegalii, wirusa Epsteina-Barr i wirusa grypy.
Poza membraną i materiałem płytki, kolor płytki może również znacząco wpływać na sukces FluoroSpot. Dane przedstawione na Rysunku 3 podkreślają różnice w jakości obrazu pomiędzy różnymi formatami płytek Multiscreen®HTS. Badanie IFNγ/IL-2 FluoroSpot przeprowadzono na komórkach PBMC po hodowli (250 tys./basenik) w obecności peptydów CEF. Z czysto wizualnego punktu widzenia wyrazistość plamek była mniej więcej taka sama na płytkach przezroczystych i czarnych (rysunek 3A). Natomiast białe płytki wykazywały wysoki sygnał tła, co utrudniało wykrywanie plamek, szczególnie w kanale zielonym (IFNγ-FITC). Wysokie tło występowało nawet po znacznym skróceniu czasu ekspozycji (około 1/5). Wysokie tło było najprawdopodobniej spowodowane zwiększonym współczynnikiem odbicia w porównaniu z czarnymi lub przezroczystymi ramkami, w których światło jest odpowiednio pochłaniane lub przechodzi przez otaczający materiał płytki. Porównanie liczby plamek wykazało znaczne zmniejszenie liczby "zliczonych plamek" na białych płytkach w porównaniu z czarnymi lub przezroczystymi formatami (rysunek 3B-C). Po raz kolejny rozbieżność była bardziej znacząca w przypadku plamek IFNγ, gdzie zaobserwowano prawie 80% redukcję całkowitej liczby plamek. Problem tła można wyeliminować, jeśli studzienki zostaną wykrojone i przeanalizowane osobno; może to jednak nie być praktyczne, jeśli mają być przeprowadzone duże eksperymenty. Biorąc pod uwagę ich podobieństwa w działaniu, format przezroczystej płytki oferuje bardziej praktyczną opcję, ponieważ ułatwia również wizualne monitorowanie dodawania odczynników. Należy zauważyć, że wszystkie analizy zostały przeprowadzone przy użyciu systemu iSpot™ (AID). Ze względu na różnice w charakterystyce działania, inne fluorescencyjne czytniki płytek mogą nie wykazywać takich samych preferencji.
Rysunek 3.Przedstawiono reprezentatywne obrazy studzienek dla dwukolorowego IFNγ/IL-2 FluoroSpot wykonanego na całkowitym PBMC w trzech różnych formatach płytek Multiscreen®HTS (Clear, Black i White) przy użyciu zestawów FluoroSpot firmy Mabtech. W przypadku dołków stymulowanych CEF wyświetlane są obrazy dla każdej cytokiny, a także obraz nakładki. W przypadku niestymulowanych studzienek pokazano tylko jednokolorowe dane IFNγ. (B) Wykres przedstawia dane sumaryczne dla każdego formatu płytki w trzech warunkach hodowli. Każdy słupek jest podzielony na trzy części - IFNγ, IL-2 i punkty podwójnej odpowiedzi. Wszystkie słupki reprezentują średnią z 3 powtórzeń. (C) Dwa wykresy słupkowe przedstawiają porównawcze dane punktowe dla każdej mierzonej cytokiny. Wszystkie słupki reprezentują średnią z 3 powtórzeń.
W przeciwieństwie do cytometrii przepływowej, w której zalewanie urządzenia może spowodować utratę próbki, każda komórka w ELISpot jest mierzona. ELISpot wymaga również średnio o jedną dziesiątą mniej komórek na test, co stanowi kluczową zaletę w warunkach, w których próbki są cenne (odległe miejsca) i/lub ograniczone (pacjenci pediatryczni lub osoby z obniżoną odpornością). Jednym z długotrwałych problemów z 96-dołkowymi mikropłytkami było marnowanie niewykorzystanych dołków w testach na małą skalę, takich jak te występujące w analizie diagnostycznej pojedynczej próbki pacjenta. Oferujemy 8-dołkowe paski (nr produktu M8IPS4510) przeznaczone dla społeczności diagnostycznej; ten format jest szczególnie atrakcyjny dla krajów o ograniczonych zasobach, w których choroby takie jak gruźlica i HIV są najbardziej wyniszczające (rysunek 4A). 28 Paski zbudowane w przezroczystym formacie są odpowiednie dla FluoroSpots, a także standardowych opcji enzymatycznych i działają porównywalnie do standardowej płytki 96-dołkowej (rysunek 4B, 5). 8-dołkowe paski są obecnie częścią testu T-SPOT.TB firmy Oxford Immunotech, zatwierdzonego przez FDA testu IFNγ ELISpot zaprojektowanego specjalnie do diagnozowania zakażenia gruźlicą.
Rysunek 4.(A) 8-dołkowa płytka paskowa z membranowym dnem zaprojektowana specjalnie do diagnostyki ELISpot. Ten format jest częścią T-SPOT.TB (Oxford Immunotech), dostępnego w sprzedaży zestawu IFNγ ELISpot zaprojektowanego specjalnie do diagnostyki zakażeń gruźlicą. (B) Reprezentatywne obrazy (pojedyncze i nałożone) z dwukolorowego testu FluoroSpot wykonanego na 8-dołkowych paskach. IFNγ/IL-2 FluoroSpot wykonano na zdrowych PBMC pozostawionych bez leczenia i po stymulacji peptydami CEF. Wszystkie testy przeprowadzono przy użyciu zestawów FluoroSpot (Mabtech).
Rysunek 5.8-dołkowe paski działają podobnie do standardowych 96-dołkowych płytek MultiScreen®. Wykres słupkowy przedstawia dane sumaryczne dla każdego formatu w trzech warunkach hodowli. Każdy słupek jest podzielony na trzy części - IFNγ, IL-2 i punkty podwójnej odpowiedzi. Wszystkie słupki reprezentują średnią z 3 powtórzeń. Praca ze znacznie mniejszą liczbą komórek na test oznacza również, że można wykonać wiele powtórzeń, zwiększając w ten sposób moc statystyczną. Taka zdolność dyskryminacyjna nie jest możliwa w przypadku testów masowych. Chociaż testy ELISpot i cytometrii przepływowej mają podobne etapy protokołu, pozyskiwanie/analiza danych ELISpot jest znacznie łatwiejsza do wykonania i mniej czasochłonna niż cytometria przepływowa. W rzeczywistości dane z 96-dołkowej płytki ELISpot mogą być pozyskiwane i analizowane przez platformę opartą na obrazach tak szybko, jak wykwalifikowany operator cytometru przepływowego analizuje jedną próbkę zawierającą 300 000 komórek. W przypadku niektórych cytokin stosunek sygnału do szumu dla ICS jest niski i często rozkłada się niebimodalnie, co sprawia, że decyzje dotyczące bramkowania są arbitralne i trudne. Podczas gdy cytometria przepływowa boryka się z brakiem niezależnych od użytkownika algorytmów bramkowania do analizy subpopulacji, a zatem cierpi z powodu subiektywności i zmienności między laboratoriami, zautomatyzowane platformy promują standaryzację analizy danych ELISpot i większą powtarzalność w różnych lokalizacjach31. Ta kombinacja cech sprawia również, że ELISpot jest idealnym wyborem do zastosowań w testach o wysokiej przepustowości, które mogą być stosowane w profilowaniu podmiotów na dużą skalę. Na przykład, testy ELISpot IFNγ są powszechnie stosowane jako korelat skuteczności szczepionek w celu identyfikacji potencjalnych kandydatów na HIV i inne choroby.32-33
Miniaturyzacja testów może jednocześnie zmniejszyć wymagania dotyczące komórek przy jednoczesnym zwiększeniu przepustowości. Dane przedstawione na Rysunku 6 są częścią trwających badań prowadzonych w Cellular Technology Limited (CTL) w celu walidacji zastosowania ELISpots do formatu 384-dołkowego.34 W tym przykładzie, IFNγ ELISpots przeprowadzono na PBMC po stymulacji peptydem CEF-7. Płytki zostały zobrazowane i przeanalizowane przy użyciu mikroanalizatora ImmunoSpot® S6 firmy CTL. Dla badanego zakresu gęstości wysiewu test wykazał silną liniową zależność (R2=0,9866) między jednostkami tworzącymi plamki (SFU) a liczbą komórek (rysunek 6B). Wreszcie, modyfikacje konstrukcji mikropłytek zwiększyły kompatybilność z istniejącymi systemami robotyki, poprawiając tym samym potencjalną przepustowość. Te adaptacje płytek obejmują bardziej rygorystyczne specyfikacje wymiarowe i sztywne ściany boczne. Płytki są teraz w pełni kompatybilne ze standardowymi platformami hydraulicznymi, myjkami do płytek oraz urządzeniami do obrazowania i analizy obrazu.35
Rysunek 6.(A) Reprezentatywny obraz z IFNγ ELISpot wykonanego na płytkach 384-dołkowych na czterech gęstościach wysiewu PBMC (n=96 na poziom). Dołek F12 został powiększony w celu wykazania przejrzystości plamki. (B) Na tym wykresie jednostki tworzące plamkę IFNγ (SFU) zostały wykreślone względem gęstości wysiewu. Każdy punkt danych reprezentuje średnią z 96 powtórzeń, a słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. Test wykazuje silną liniową odpowiedź dla zakresu badanych ilości komórek.
Optymalizacja ELISpot
Podczas gdy testy ELISpot pozwalają na określenie częstotliwości dla bardzo rzadkich zdarzeń, interpretacja danych może stać się niejednoznaczna, gdy (1) liczba plamek w studzienkach zawierających antygen jest niska, (2) liczba plamek w studzienkach kontroli negatywnej jest podwyższona, a zwłaszcza gdy oba te zjawiska występują jednocześnie. Dlatego podstawowym zadaniem, nawet przed zastosowaniem statystyk, musi być optymalizacja podstawowych parametrów testu i odczynników w celu maksymalizacji stosunku sygnału do szumu. Podczas gdy użycie wysoce specyficznych par Ab zatwierdzonych przez ELISpot jest kluczem do sukcesu testu, właściwe rozważenie i wykonanie szeregu innych kroków jest wymagane w celu zapewnienia optymalnej wydajności. Ta sekcja zawiera przegląd standardowego testu ELISpot dla komórek T, ze szczególnym naciskiem na eksperymentalne uzasadnienie kluczowych kroków i sugestie dotyczące rozwiązywania problemów z błędnymi lub niejednoznacznymi wynikami.
Initial Thoughts
Wybór płytki (membrany)
Płytki membranowe PVDF (nr kat. MSIPS4W10, MSIPS4510, MAIPSWU10, MAIPS4510) są zalecane w porównaniu z mieszanym formatem estrów celulozy (nr katalogowy MSHAS4510), ze względu na nieco lepsze wiązanie wychwytu Ab i lepszą wydajność w wykrywaniu punktowym, szczególnie w zastosowaniach fluorescencyjnych. Jedyną wadą płytek PVDF jest ekstremalna hydrofobowość materiału,33 właściwość, która może wymagać wstępnego zwilżenia alkoholem przed dodaniem powłoki Ab. Potencjalne pułapki tego etapu zostały opisane w dalszej części. Ponieważ mieszana membrana celulozowa jest hydrofilowa, testy ELISpot mogą być wykonywane bez wstępnego zwilżania,36,37
Kontrole negatywne/pozytywne
Odpowiednie kontrole mają kluczowe znaczenie dla pomiaru odpowiedzi specyficznej dla Ag za pomocą ELISpot. Kontrole negatywne rutynowo składają się z komórek hodowanych bez bodźców, podczas gdy poliklonalne aktywatory limfocytów T są powszechnie stosowane jako kontrole pozytywne w celu potwierdzenia zarówno funkcjonalności komórek, jak i testu. Kontrole pozytywne obejmują anty-CD3/CD28 Abs, fitohemaglutyninę (PHA) i konkanawalinę A (ConA). Aktywatory te indukują wydzielanie wielu popularnych cytokin, w tym IFNγ, IL-2 (Th1), IL-4, IL-5, IL-10 i IL-13 (Th2). Inną powszechnie stosowaną kontrolą są dostępne na rynku pule peptydów CEF (wirus cytomegalii, wirus Epsteina-Barr, wirus grypy). Składają się one z wielu epitopów z każdego z trzech wirusów, na które większość zdrowych osób (~ 90%) posiada limfocyty T odpowiadające na CD8.38
Organizacja płytki - efekty krawędziowe
Płytka składa się z 8 rzędów z 12 dołkami w każdym. Studzienki na obrzeżach płytki (kolumny 1 i 12, rzędy A i H) mają większy bezpośredni kontakt z otaczającym środowiskiem, a zatem mogą różnić się od studzienek wewnętrznych. W szczególności parowanie pożywki z dołków obwodowych w długotrwałych hodowlach może mieć wpływ na ogólną wydajność testu. Tam, gdzie jest to możliwe, zastosowanie studzienek "tylko z pożywką" na obrzeżach studzienek z prawdziwymi próbkami może zminimalizować ten efekt.
Kwestia wstępnego zwilżania
Testy porównawcze wykazały wcześniej, że właściwa obróbka wstępna etanolem płytek HTS MultiScreen® opartych na PVDF (15 µl) może mieć negatywny wpływ na wydajność testu.HTS (15 µl świeżo przygotowanego 35% v/v etanolu, a następnie natychmiastowe płukanie wodą) może prowadzić do zwiększenia liczby plamek (lepsza czułość) i ostrzejszych plamek (dla dokładniejszego oznaczania ilościowego) (rysunek 7)35. Niemniej jednak, wstępne zwilżanie nie ma uniwersalnego zastosowania do wszystkich ELISpotów; jego wymóg zależy od nieodłącznej hydrofobowości wychwytującego Ab; dlatego protokół wstępnego zwilżania powinien zostać zoptymalizowany przed zastosowaniem35,36. Nadmierna obróbka z użyciem większych objętości alkoholu, dłuższego czasu ekspozycji lub bardziej stężonego alkoholu może prowadzić do uwięzienia resztkowej cieczy między membraną a drenem, co może skutkować słabą wydajnością testu lub, co ważniejsze, wyciekiem ze studzienki. Wyciek związany ze wstępnym zwilżaniem alkoholem nie jest problemem w przypadku korzystania z płytek ELISpot bez drenażu (nr katalogowy MAIPSWU10); jednak ten format może cierpieć z powodu potencjalnego parowania mediów podczas przedłużonej hodowli, a także kwestii sterylności związanych z odsłoniętą membraną podstawową. Inną alternatywą jest użycie mikropłytek wykonanych z hydrofilowej membrany, takiej jak mieszany ester celulozy. Ważne jest również, aby pamiętać, że po poddaniu płytek działaniu etanolu, muszą być one utrzymywane w stanie mokrym przez cały czas trwania testu.
Rysunek 7.(A) Reprezentatywne obrazy studzienek dla mysiego IFN gamma ELISpot wykonane na płytkach z membraną PVDF z i bez wstępnego zwilżania etanolem. (B) Schemat przedstawiający architekturę pojedynczego dołka na płytce MultiScreen®HTS. Niedawne zmiany konstrukcyjne mające na celu zwiększenie odstępu między podstawą membrany a górną częścią drenu zmniejszyły częstotliwość wycieków.
Powlekanie przeciwciałem wychwytującym
W tradycyjnych testach ELISA wiązanie z powierzchnią następuje poprzez pasywną adsorpcję i wymaga warunków alkalicznych (0,2 M węglanu sodu/wodorowęglanu pH>9), aby zmaksymalizować elektrostatyczny składnik interakcji białko:polistyren. Natomiast powlekanie membran PVDF dla ELISpot odbywa się wyłącznie za pośrednictwem sił hydrofobowych. Z tego powodu powszechnie stosowany jest bufor soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (pH 7,4). Membrany oferują również znacznie większą powierzchnię (300x) do wiązania niż płytki polistyrenowe39. Aby zapewnić wydajność przy jednoczesnej maksymalizacji efektywności kosztowej, kluczowe znaczenie ma standaryzacja ilości wychwytu Ab używanego na studzienkę. Aby uzyskać optymalną wydajność, zalecamy wstępne miareczkowanie zarówno Abs powlekających, jak i wykrywających w tandemie. Zazwyczaj dobrym punktem wyjścia dla powlekania ELISpot jest 0,5-1 µg Ab na studzienkę (5-10 µ/mL w 100 µL); jest to 5-10 razy większy wkład niż w przypadku testów ELISA. Niższy wkład może skutkować bardziej rozproszoną morfologią plamki, a także zmniejszoną liczbą plamek. Oba parametry należy wziąć pod uwagę przy walidacji nowych protokołów testów, szczególnie przy określaniu ilościowej ekspresji (wielkość plamki) lub zdarzeń o niskiej częstotliwości. Mabtech oferuje szeroką gamę w pełni zwalidowanych par ELISpot Ab (powlekanie i wykrywanie) do badania próbek ludzkich, a także innych gatunków (szczegółowe informacje można znaleźć na stronie www.mabtech.com).
Krok blokowania
Po inkubacji z wychwytującym Ab, płytki należy dokładnie umyć, a następnie zablokować i wyrównać przez 2 godziny w temperaturze 37 °C z tym samym podłożem hodowlanym (200 µL/basenik), które będzie używane podczas stymulacji komórek (bez aktywatora). Po umieszczeniu w pożywce blokującej, zamknięte płytki PVDF mogą być przechowywane przez noc w temperaturze 4 °C. Dłuższe przechowywanie może spowodować wytrącanie się białka i zmniejszenie rozdzielczości plamki. Ważne jest, aby pamiętać, że gdy płytki zostaną usunięte z temperatury 4 ° C i pozostawione do osiągnięcia temperatury pokojowej, taśma uszczelniająca musi również zostać usunięta, aby zapobiec wyciekom spowodowanym rozszerzaniem się gazu.
Cells - Plating and Stimulation
Fresh vs. Frozen
PBMCs lub wzbogacone podzbiory komórek T stanowią większość testów ELISpot. Po oczyszczeniu z krwi, PBMC mogą być kriokonserwowane i rozmrażane bez utraty aktywności funkcjonalnej40. Biorąc pod uwagę często cenny charakter próbek chorobowych, kriokonserwacja przynosi wiele korzyści: (1) dane mogą być niezależnie odtwarzane, (2) można ocenić wiele analitów, (3) próbki pacjentów mogą być gromadzone i badane jednocześnie, minimalizując w ten sposób potencjalną zmienność między testami. Aby uzyskać optymalny odzysk żywych komórek, należy postępować zgodnie z następującymi zaleceniami: (A) podczas zamrażania, komórki i pożywka do zamrażania powinny mieć temperaturę pokojową przed zmieszaniem oraz (B) podczas rozmrażania, aby zminimalizować lizę osmotyczną podczas płukania rozmrożonych komórek, należy przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml na lodzie i powoli dodawać zimną pożywkę.
Korzyści płynące ze stosowania Benzonazy® Nukleazy
Dodatkowym wyzwaniem związanym z użyciem zamrożonych PBMC jest zlepianie się komórek podczas procesu rozmrażania. Zlepianie się komórek jest często spowodowane obecnością wolnego DNA i resztek komórek; wydaje się, że jest to związane zarówno ze źródłem dawcy, jak i obróbką krwi. W szczególności zlepianie się komórek występuje częściej, gdy krew była przechowywana przez noc przed izolacją PBMC. Wyniki zliczania punktowego dla krwi przechowywanej przez noc wykazały dramatyczny spadek w porównaniu z odpowiedziami dla odpowiednich PBMC wyizolowanych ze świeżej krwi.36 Największe spadki sygnału wykryto dla próbek, w których zaobserwowano najwyższy stopień zlepiania się komórek. Aby poprawić wydajność testu, zalecamy dodanie nukleazy Benzonase® (nr produktu 71205), która degraduje wszystkie formy DNA i RNA, do pożywki testowej w pierwszych dwóch etapach płukania podczas procedury rozmrażania. Wyniki uzyskane z krwi PBMC przetworzonej przez noc z użyciem nukleazy Benzonase® są bardziej zbliżone do wyników uzyskanych z komórek wyizolowanych ze świeżej krwi. Ponadto dodanie nukleazy Benzonase® nie spowodowało zmian w żywotności komórek ani zmian w ekspresji niektórych markerów powierzchniowych, w tym CD4, CD8, CD38 lub CD62L.36
Liczenie komórek i wartość procentowej żywotności
Po standaryzacji etapów Ab, różnice w ilościowej wydajności komórek i integralności każdej próbki stanowią największe źródło zmienności testu. Podczas gdy całkowita liczba komórek jest ważna, bardziej krytycznym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę podczas konfigurowania komponentu hodowlanego, jest żywotność komórek. Określenie odsetka martwych i apoptotycznych komórek jest nie tylko ważne dla konfiguracji hodowli, ale także dostarcza ilościowych informacji na temat ogólnej jakości próbki. Ten ostatni element jest szczególnie przydatny przy ocenie powodzenia/niepowodzenia procesu zamrażania/rozmrażania. Ręczne metody liczenia, takie jak wykluczenie błękitu Trypana przy użyciu hemacytometru, nie są dokładne ze względu na subiektywność użytkownika. Co więcej, metody te nie zapewniają pomiaru frakcji apoptotycznej. Zautomatyzowane zliczanie komórek za pomocą cytometrii przepływowej z wykorzystaniem barwników fluorescencyjnych, takich jak analizator komórek Muse™ i odczynnik ViaCount® wykazały wyższą precyzję niż metody ręczne do zliczania żywych komórek.41
Komórki na studzienkę i replikaty
Przeciętnie, liczba komórek T ELISpot wykazuje liniowość dla PBMC w zakresie 100 000-800 000 komórek5,9-13. Tam, gdzie to możliwe, komórki powinny być seryjnie rozcieńczane i posiewane w trzech egzemplarzach. Niestety, biorąc pod uwagę ograniczenia wielkości studzienek w płytkach 96-dołkowych (0,3 cm2), wysiewanie więcej niż 400 000 komórek na studzienkę może skutkować przepełnieniem i układaniem komórek w stosy. Konsekwencją tego jest tworzenie rozproszonych plam z powodu pośredniego kontaktu komórek z membraną pokrytą Ab. Aby jak najlepiej monitorować przypadki, w których częstotliwość reagentów specyficznych dla Ag jest niska i wymagane jest większe obciążenie komórek, należy wykonać testy w większych studzienkach lub wykonać replikację studzienek przy maksymalnej gęstości komórek. Korzystając z replikowanych dołków, można zsumować liczbę plamek ze wszystkich dołków, aby uzyskać częstotliwość odpowiedzi (SFU / całkowita liczba wysianych komórek).
Podczas inkubacji nie zalecamy układania płytek w stosy, ponieważ może to prowadzić do zmian temperatury między płytkami i potencjalnie różnic w wielkości i / lub liczbie plamek. Ważne jest również, aby płytki były poddawane minimalnemu mieszaniu, ponieważ ruch może prowadzić do zlokalizowanej dyfuzji cytokin i utraty ostrości plamki.
Detection - Chromogenic vs. Fluorescent options
Po stymulacji komórki są usuwane, dołki są intensywnie płukane i nakładany jest drugi Ab specyficzny dla analitu. Na tym i wszystkich kolejnych etapach płukanie ma kluczowe znaczenie dla całkowitego usunięcia komórek, niespecyficznie związanego Ab i odczynnika wykrywającego. Niekompletne usunięcie niezwiązanych odczynników doprowadzi do ogólnego wzrostu sygnału tła. Potencjalne wyzwania związane z płukaniem i tworzeniem plamki zostaną omówione w sekcji rozwiązywania problemów (strona 10).
ELISpot testy mogą być wykonywane albo z przeciwciałami bezpośrednio sprzężonymi z motywem wykrywania (enzymem lub fluorochromem), albo jako dwuetapowy proces obejmujący parę Ab sprzężoną z biotyną/streptawidyną. Podczas gdy dwuetapowy proces oferuje większą intensywność ze względu na wzmocnienie sygnału, a zatem może być preferowany w przypadkach, w których produkcja cytokin na komórkę jest niska (alergia / odpowiedzi Th2), protokół ten ma również większy potencjał do barwienia tła z powodu niespecyficznej interakcji z powłoką Ab. W przypadku enzymów, takich jak peroksydaza chrzanowa (HRP), do wykrywania plamek stosuje się substrat strącający (TMB lub AEC). Ze względu na wysoki wskaźnik rotacji HRP, rozwój plamki jest szybki (≤5 minut). W przeciwieństwie do tego, rozwój plamki przy użyciu Abs sprzężonego z fosfatazą alkaliczną jest znacznie wolniejszy, ale przy znacznie niższym tle. W przypadku testów chromogenicznych wykonywanych na płytkach MultiScreen®HTS (tych z drenem) zaleca się usunięcie drenu przed dodaniem substratu; niezastosowanie się do tego zalecenia może spowodować wysokie zabarwienie tła. Po usunięciu płytki należy podeprzeć, aby zminimalizować kontakt z membraną. Aby poprawić wizualizację plamek, płytki należy suszyć bez pokrywki, do góry nogami, w temperaturze pokojowej przez kilka godzin. W przypadku długotrwałego przechowywania, płytki powinny być przechowywane w ciemnym, suchym miejscu w temperaturze pokojowej, aby zapobiec bieleniu plamek.
Jak omówiono wcześniej, zastosowanie koniugatów fluorescencyjnych oferuje znaczące korzyści w porównaniu ze schematami kolorymetrycznymi, szczególnie w przypadku zastosowań podwójnych cytokin lub gdy pożądana jest większa ocena ilościowa poszczególnych plamek. Podczas gdy Abs sprzężone z FITC i Cy3 są powszechnie stosowane, wybór sondy fluorescencyjnej jest ograniczony jedynie dostępnością koniugatów i platform detekcji.
Liczenie i analiza plamek - co to jest prawdziwa plamka?
Każda plamka reprezentuje "sygnaturę cytokin" pojedynczej komórki. Ze względu na właściwości dyfuzyjne, prawdziwa plamka ma gęsto zabarwiony środek, który zanika w kierunku krawędzi; rozmiar i / lub intensywność koloru plamek zależy od ilości uwolnionej cytokiny. To powiedziawszy, ze względu na różnice w mierzonym analicie, czasie inkubacji, stężeniu przeciwciał, aktywności enzymu, substratach i innych użytych materiałach, a także stanie funkcjonalnym komórek wydzielających cytokiny, rozmiar i gęstość plamek mogą się znacznie różnić. Mogą pojawić się sztuczne plamki, które mogą być spowodowane agregacją przeciwciał lub niekompletnym usunięciem komórek i resztek komórkowych. Morfologicznie, plamki te można odróżnić od "prawdziwych" plamek poprzez ich jednorodność w intensywności koloru i ostrzejsze (nie zaokrąglone) krawędzie.
Z powyższego opisu wynika, że ręczne liczenie plamek za pomocą mikroskopii świetlnej można sklasyfikować jako wysoce subiektywny proces, obarczony dużym stopniem zmienności między użytkownikami. Ponadto, biorąc pod uwagę samą liczbę studzienek, które mogą wymagać ilościowego określenia w standardowych badaniach szczepionek, zadanie analizy danych ELISpot staje się zbyt pracochłonne dla ludzkich oczu. Dostępność zaawansowanych czytników ELISpot oferuje kompletne rozwiązanie do precyzyjnej oceny danych punktowych. Urządzenia te posiadają funkcje pozwalające na przezwyciężenie problemów związanych ze zmienną intensywnością tła oraz zdolność do odróżniania prawdziwych pojedynczych plamek komórek od artefaktów. Ta ostatnia zdolność opiera się na wykorzystaniu minimalnych i maksymalnych wartości progowych dla wielkości i intensywności plamki, co pozwala na wykluczenie odpowiednio słabych reakcji osób postronnych i skupisk zawierających wiele komórek. Oprócz szybkości, oprogramowanie do analizy plamek oferuje standaryzację procesu, co jest krytycznym elementem, gdy badania są przeprowadzane w różnych ośrodkach, jak ma to miejsce w przypadku testów diagnostycznych i badań szczepionek. Co więcej, czytniki ELISpot i oprogramowanie do analizy otwierają drzwi do bardziej precyzyjnych pomiarów plamek, umożliwiając ilościowe wydzielanie wielu cytokin w przeliczeniu na komórkę.
A Troubleshooting Guide for Interpreting and Correcting Ambiguous Elispot Result
1. Wysoki poziom barwienia tła
2. Brak miejsc/puste otwory
3. Rozmyte/słabo zdefiniowane/płynne miejsca
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować Tomasowi Ernemarowi (Mabtech) za dostarczenie wszystkich danych FluoroSpot oraz recenzję manuskryptu. Dane z 384 dołków zostały uprzejmie dostarczone przez Jodie Hansen (CTL). Chcielibyśmy również podziękować Sylvii Janetzki (ZellNet Consulting) za recenzję manuskryptu.
Referencje
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?