Co to jest Hot Start PCR?

Hot Start PCR Video

Hot start PCR to wariant reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) opracowany w celu tłumienia aktywności enzymatycznej (zwykle Taq polimerazy DNA) do czasu zakończenia pierwszego etapu denaturacji. Pozwala to uniknąć sytuacji, w której reakcja PCR przebiega w temperaturze pokojowej podczas konfiguracji testu (i przed cyklem termicznym), gdy może wystąpić niespecyficzna amplifikacja, będąca przyczyną niepowodzenia PCR.

Ten film Hot Start PCR pokaże, w jaki sposób nasz Odczynniki Hot Start PCR i metody osiągają tłumienie aktywności enzymatycznej poprzez modyfikacje polimerazy DNA, blokują amplifikację i pozostają nieaktywne do czasu osiągnięcia wyższych temperatur.

Dowiedz się więcej o naszym kompletnym portfolio PCR i jak wybrać odpowiednie odczynniki do swojego eksperymentu.

Hot Start PCR Video Transcript

Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR)  to metoda amplifikacji określonych fragmentów DNA. Podczas konfiguracji testu, przed cyklem termicznym, gdy reakcje PCR przebiegają w temperaturze pokojowej, może wystąpić niespecyficzna amplifikacja, która prowadzi do niepowodzenia PCR.

Aby uniknąć niespecyficznej amplifikacji, opracowano kilka metod znanych jako hot start PCR które tłumią aktywność enzymatyczną PCR do czasu zakończenia pierwszego etapu denaturacji.

Metody PCR z gorącym startem osiągają to poprzez modyfikacje polimerazy DNA - w celu zablokowania amplifikacji i pozostania nieaktywnym do czasu osiągnięcia wyższych temperatur.  Typowe modyfikatory polimerazy DNA obejmują mechanizmy chemiczne, przeciwciała lub aptamery.

W reakcji PCR masz matrycę, która zawiera sekwencję docelową, którą jesteś zainteresowany. Potrzebne są również startery, dNTP i wybrana polimeraza DNA typu hot-start.

Polimeraza DNA typu hot-start pozostanie nieaktywna w temperaturze pokojowej ponieważ dodano enzym typu hot-start. Dlatego nie musisz się martwić, że amplifikacja rozpocznie się przed wejściem do termocyklera.

Denaturacja jest pierwszym krokiem w reakcji PCR. Termocykler nagrzewa się do około 95 stopni Celsjusza, co powoduje roztopienie dwuniciowej helisy DNA na dwie jednoniciowe matryce DNA. Jednocześnie ciepło z tego etapu aktywuje również polimerazę DNA - stąd gorący start. 

Podczas etapu wyżarzania temperatura spada do 45-65 stopni Celsjusza, a jednoniciowe startery przyłączają się do odpowiednich końców sekwencji docelowej.

Podczas tego cyklu polimeraza DNA przyłącza się do starterów i rozpoczyna przyłączanie komplementarnych nukleotydów.

Na koniec, podczas wydłużania, temperatura nieznacznie wzrasta do 65-75 stopni Celsjusza. Polimeraza DNA rozszerza starter specyficzny dla sekwencji z włączeniem nukleotydów, które są komplementarne do matrycy DNA.

Po powtórzeniu cykli denaturacji, annealingu i wydłużania około 35-40 razy, replikacja jest zakończona, a nowo wygenerowane dwuniciowe DNA może być wykorzystane do analizy poamplifikacyjnej.

Odczynniki do PCR muszą zapewniać spójną i specyficzną amplifikację DNA z wysoką wydajnością. Dzięki zastosowaniu metod PCR z gorącym startem amplifikacja DNA może przynieść korzyści w postaci: zmniejszonej niespecyficznej amplifikacji, zwiększonej wydajności docelowej i zwiększonej czułości.

Ponieważ metody gorącego startu różnią się poziomami wierności, szybkości i wygody, zalecamy skorzystanie z przewodnika wyboru PCR i naszego zespół wsparcia technicznego aby wybrać produkty odpowiednie dla Ciebie.