Ludzkie hematopoetyczne komórki progenitorowe (HPC) i pożywki wzrostowe

Produkty te są dostępne w Stanach Zjednoczonych, Kanadzie i wybranych krajach europejskich.

• Hematopoietic Progenitor Cell Culture System
• Protokoły hodowli ludzkich komórek progenitorowych CD34+
• Kontrola jakości systemu hodowli ludzkich krwiotwórczych komórek macierzystych
• Materiały do hodowli ludzkich hematopoetycznych komórek progenitorowych

System hodowli hematopoetycznych komórek progenitorowych

CD34 jest glikozylowanym białkiem transmembranowym, które służy jako dobrze znany marker dla prymitywnych komórek progenitorowych krwi i szpiku kostnego, w szczególności dla progenitorów hematopoetycznych i śródbłonkowych. Chociaż biologiczne funkcje CD34 są w dużej mierze nieznane, ostatnie dane sugerują, że CD34 jest zaangażowany w utrzymanie komórek progenitorowych w fenotypowo niezróżnicowanym stanie.

PromoCell^® CD34⁺ Progenitor Cells są izolowane z krwi pępowinowej zdrowych dawców. Komórki progenitorowe CD34⁺ nadają się do różnorodnych badań, a także do ukierunkowanego różnicowania w bardziej zaangażowane fenotypy komórek krwi i linie śródbłonka.Natychmiast po izolacji, świeżo przygotowane komórki progenitorowe CD34⁺ Progenitor Cells są kriokonserwowane przy użyciu zastrzeżonego, niezawierającego surowicy medium do zamrażania - Cryo-SFM. Każda kriowialka zawiera co najmniej 100 000 żywych komórek po rozmrożeniu.

Protokół hodowli ludzkich komórek progenitorowych CD34⁺ Progenitor Cells

• Ekspansja ludzkich krwiotwórczych komórek progenitorowych w pożywce bez surowicy<

Podłoże do ekspansji hematopoetycznych komórek progenitorowych zostało opracowane specjalnie do ekspansji HPC i jest dostępne w dwóch formułach.Pożywki te są dostarczane w zestawach składających się z butelki pożywki podstawowej i jednej fiolki mieszanki uzupełniającej. Dodanie SupplementMix do Basal Medium stanowi kompletną pożywkę.

• Hematopoietic Progenitor Cell (HPC) Expansion Medium DXF jest przeznaczony do maksymalnej ekspansji prymitywnych HPC w pełni zdefiniowanym, wolnym od ksenogenów środowisku hodowlanym. Ze względu na zastosowanie wyłącznie syntetycznych, rekombinowanych lub roślinnych materiałów, pożywka ta jest zdefiniowana i wolna od wszelkich składników pochodzenia zwierzęcego, jak również substancji pochodzenia ludzkiego, z wyjątkiem albuminy surowicy ludzkiej.
• Hematopoietic Progenitor Medium (Ready-to-use) została opracowana do ekspansji progenitorów hematopoetycznych poprzez różnicowanie w bardziej zaangażowane linie komórek krwi. W związku z tym ta pożywka progenitorowa jest odpowiednia do testów opartych na CFU, takich jak testy komórek inicjujących długotrwałą hodowlę (LTC-IC).  Pożywka ta jest zoptymalizowana dla pierwotnych komórek ludzkich, ale może być również stosowana do pierwotnych komórek ziarnistych (GC) z pęcherzyków bydlęcych, a także pierwotnych mysich komórek jednojądrzastych.

Uwaga: Aby osiągnąć optymalną wydajność, kompletna pożywka do ekspansji hematopoetycznych komórek progenitorowych (HPC) DXF musi być uzupełniona przez użytkownika dodatkowymi czynnikami wzrostu. Cytokine Mix E jest gotową do użycia mieszanką czynników wzrostu opcjonalnie dostępną dla HPC Expansion Medium DXF. Wolna od składników zwierzęcych, zdefiniowana formuła zawiera rekombinowaną ludzką TPO (trombopoetynę), SCF (czynnik komórek macierzystych), ligand flt-3 i IL-3. Zoptymalizowana formuła pozwala na intensywną ekspansję hematopoetycznych komórek progenitorowych, przy jednoczesnym zachowaniu ich prymitywnego fenotypu i zakazie różnicowania.

Szczegóły suplementacji Hematopoietic Progenitor Medium

Hematopoietic Progenitor Medium zawiera wszystkie czynniki wzrostu i suplementy niezbędne do zdrowej ekspansji komórek progenitorowych. HPC Expansion Medium DXF musi zostać uzupełnione przez użytkownika o dodatkowe czynniki wzrostu. Dostępne suplementy obejmują opcjonalnie dostępną mieszankę cytokin E (nr produktu C-39890, 1 ml lub C-39891, 5 ml) zawierającą rekombinowane ludzkie TPO, SCF, ligand flt-3 i IL-3. Użytkownik może jednak dostosować pożywkę poprzez dodanie innych czynników wzrostu. Hematopoietic Progenitor Media nie zawierają antybiotyków ani środków przeciwgrzybiczych i są przeznaczone do stosowania w inkubatorze z atmosferą 5% CO₂.

Przygotowanie uzupełnionej pożywki do użycia

• Odmrozić mieszaninę suplementów w temperaturze 15-25°C.
• Septycznie wymieszać roztwory suplementów przez ostrożne pipetowanie w górę i w dół.
• Przenieś całą zawartość każdego suplementu do Basal Medium.
• Zamknij butelkę i delikatnie wiruj, aż do uzyskania jednorodnej mieszaniny.

Ważna uwaga: W przypadku Hematopoietic Progenitor Cell (HPC) Expansion Medium DXF, należy również rozmrozić Cytokine Mix E w temperaturze 15-25°C. Aseptycznie wymieszaj roztwory, ostrożnie pipetując w górę i w dół. Przenieś całą zawartość do odpowiedniej ilości kompletnego podłoża. Zamknij butelkę i delikatnie wiruj, aż do uzyskania jednorodnej mieszaniny. Jeden mililitr mieszanki cytokin E wystarcza do uzupełnienia 100 ml podłoża do ekspansji HPC DXF.Alternatywnie można uzupełnić HPC Expansion Medium DXF wybranymi czynnikami wzrostu.

Przechowywanie i stabilność pożywek i suplementów do komórek krwiotwórczych

• Po dostarczeniu natychmiast przechowywać pożywkę podstawową w temperaturze 4-8°C w ciemności; nie zamrażać pożywki podstawowej. SupplementMix należy przechowywać w temperaturze -20°C.
• Jeśli produkty są przechowywane zgodnie z zaleceniami, zachowują stabilność do podanej daty ważności.
• Po dodaniu suplementów do Basal Medium, okres przechowywania kompletnej pożywki wynosi sześć tygodni w temperaturze 4-8°C. Pożywkę uzupełnioną o Cytokine Mix E należy zużyć w ciągu 2 tygodni po dodaniu cytokin. Nie należy zamrażać kompletnej pożywki.
• Do użytku należy podgrzać tylko jednorazową porcję kompletnej pożywki, a pozostałą pożywkę przechowywać w lodówce w temperaturze 4-8°C.
• Po dostarczeniu, komórki poddane kriokonserwacji należy natychmiast wysiać lub przechowywać w ciekłym azocie.
• Komórki proliferujące należy natychmiast przetworzyć.

Protocols for Human CD34⁺ Hodowla komórek progenitorowych

Protokół dla kriokonserwowanych komórek hematopoetycznych

Ważne uwagi:

• Po otrzymaniu, przechowuj kriokonserwowane komórki w ciekłym azocie lub natychmiast je wysiej. Przechowywanie w temperaturze -80°C nie jest wystarczające do zachowania komórek i powoduje ich nieodwracalne uszkodzenie.
• Obsługuj komórki przy użyciu technik aseptycznych i w komorze bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym.
   

1. Przygotuj pożywkę
   Przenieś wymaganą objętość PromoCell Medium zgodnie z zalecaną gęstością wysiewu (patrz tabela poniżej) do sterylnych naczyń do hodowli komórkowych. Użyj co najmniej 9 ml pożywki na fiolkę z komórkami. W celu wyrównania temperatury umieść naczynia w inkubatorze (37°C, 5% CO₂) na 30 minut.
   
   
2. Rozmrażanie komórek
   Wyjmij fiolkę z pojemnika z ciekłym azotem i natychmiast umieść ją na suchym lodzie - nawet na czas krótkiego transportu. W warunkach przepływu laminarnego przekręć korek o ćwierć obrotu, aby zmniejszyć ciśnienie, a następnie dokręć go ponownie. Zanurzyć fiolkę w łaźni wodnej lub termicznej (37 °C) aż do zakrętki na 2 minuty. Upewnij się, że woda nie dostała się do gwintu zakrętki.
   
   
3. Dezynfekcja fiolki i wysiew komórek
   Dokładnie przepłucz fiolkę 70% etanolem w laminarnym przepływie powietrza. Następnie odessać nadmiar etanolu z obszaru gwintu zakrętki. Otwórz fiolkę i przenieś komórki do naczynia do hodowli komórkowej zawierającego wstępnie ogrzaną pożywkę z kroku 1.
   
   
4. Inkubuj komórki
   Umieść naczynie w inkubatorze (37 °C, 5% CO₂) w celu przyłączenia komórek. Wymień pożywkę po 4-8 godzinach zgodnie z protokołem subkultywacji (patrz poniżej). 

Protokół subkultywacji hematopoetycznych komórek progenitorowych

1. Zbierz komórki
   Zbierz zawiesinę komórek i określ ich liczbę.Ostrożnie odessać zawiesinę komórek i przenieść ją do probówki do wirowania. Wiruj komórki przez 3 minuty z prędkością 240 x g.
   
   
2. Resuspend and reseed cells
   Odrzuć supernatant, dodaj 1 ml odpowiedniej pożywki PromoCell® Cell Growth Medium i ponownie zawieś komórki, delikatnie pipetując w górę i w dół. Wysiej komórki zgodnie z zalecaną gęstością wysiewu do nowych naczyń do hodowli komórkowej zawierających świeżą pożywkę do hodowli komórkowej podgrzaną do temperatury 37°C. Umieść naczynia w inkubatorze (37°C, 5% CO₂).

Kontrola jakości systemu hodowli ludzkich krwiotwórczych komórek macierzystych

Human CD34⁺ Kontrola jakości komórek progenitorowych

Sztywne testy kontroli jakości są przeprowadzane dla każdej partii ludzkich komórek progenitorowych CD34⁺ Progenitor Cells.

• Rutynowo charakteryzowane za pomocą cytometrii przepływowej analizującej żywotność, rozmiar komórek i obecność istotnych markerów, takich jak CD34.
• Testowane pod kątem braku HIV-1, HIV-2, HBV, HCV, HTLV-1, HTLV-2 i zanieczyszczeń mikrobiologicznych (grzybów, bakterii i mykoplazmy).
• Szczegółowy certyfikat analizy (CoA) dla każdej partii jest dostępny do pobrania.

Specyfikacje ludzkich komórek progenitorowych CD34+

Produkt	Zalecane podłoża hodowlane	Zalecane podłoża do różnicowania	Gęstość płytek
Human CD34+ Progenitor Cells from Cord Blood (hCD34+-CB), single donor	Product No. C-28021 Nr produktu C-39891	Nr produktu C-28020*	5 000 komórek na cm²

* Ma zastosowanie do testów CFU dla hematopoetycznych komórek progenitorowych (testy LTC-IC).

Kontrola jakości hematopoetycznego podłoża progenitorowego

Wszystkie partie hematopoetycznego podłoża progenitorowego są poddawane rygorystycznym testom kontroli jakości przy użyciu pierwotnych ludzkich komórek jednojądrzastych, a także oczyszczonych hematopoetycznych komórek progenitorowych z krwi pępowinowej.Każda partia HPC Expansion Medium DXF jest testowana pod kątem zdolności do wspierania ekspansji hematopoetycznych komórek progenitorowych o prymitywnym fenotypie. Każda partia Hematopoietic Progenitor Medium jest testowana pod kątem zdolności do indukowania ukierunkowanego różnicowania w linie krwiotwórcze przy użyciu oczyszczonych komórek progenitorowych CD34⁺ z krwi pępowinowej. Ponadto wszystkie partie pożywek zostały przetestowane pod kątem braku zanieczyszczeń mikrobiologicznych (grzyby, bakterie, mykoplazma).

Przeznaczenie hematopoetycznych komórek progenitorowych i systemu pożywek

Produkty te są przeznaczone wyłącznie do użytku in vitro a nie do procedur diagnostycznych lub terapeutycznych. W celu uzyskania informacji na temat środków ostrożności należy zapoznać się z odpowiednią kartą charakterystyki substancji niebezpiecznej.

Materials for Hematopoietic Progenitor Cell Culture