Pakowanie i przygotowanie kolumny

Prepakowane kolumny firmy Cytiva zapewnią powtarzalne wyniki i najwyższą wydajność.

Używaj małych preopakowanych kolumn do badania mediów chromatograficznych i optymalizacji metod oraz w celu zwiększenia wydajności w opracowywaniu metod.

Efektywne upakowanie kolumny ma zasadnicze znaczenie dla separacji AC, szczególnie w przypadku stosowania elucji gradientowej. Źle upakowana kolumna powoduje słaby i nierównomierny przepływ, poszerzenie pasma i utratę rozdzielczości. Jeśli wymagane jest upakowanie kolumny, poniższe wytyczne będą miały zastosowanie we wszystkich skalach działania:

• W przypadku medium o wysokiej zdolności wiązania, użyj krótkich, szerokich kolumn (zwykle o wysokości złoża od 5 do 15 cm) do szybkiego oczyszczania, nawet przy niskiej prędkości przepływu.
• Ilość wymaganego medium AC będzie zależeć od zdolności wiązania medium i ilości próbki. Zdolności wiązania dla każdego medium są podane w niniejszym podręczniku i dostarczane wraz z instrukcjami dotyczącymi produktu. Oszacuj ilość pożywki wymaganą do związania próbki będącej przedmiotem zainteresowania i użyj pięciokrotności tej ilości do wypełnienia kolumny. Ilość wymaganego medium można zmniejszyć, jeśli rozdzielczość jest zadowalająca.
• Po określeniu parametrów separacji, zwiększ skalę oczyszczania, zwiększając średnicę kolumny, aby zwiększyć jej objętość. Unikaj zwiększania długości kolumny, jeśli to możliwe, ponieważ zmieni to warunki separacji.

ŚrodkiAC mogą być pakowane w kolumny Tricorn, XK lub HiScale dostępne w Cytiva (Rysunek A6.1).

Rysunek A6.1. Trwa pakowanie kolumn.

1. Wyrównać wszystkie materiały do temperatury, w której będzie przeprowadzana separacja.
2. Eliminować powietrze przez przepłukanie końcówek kolumny zalecanym buforem. Upewnij się, że powietrze nie jest uwięzione pod siatką kolumny. Zamknąć wylot kolumny pozostawiając 1 do 2 cm buforu w kolumnie.
3. Delikatnie ponownie zawiesić pożywkę.

Uwaga: pożywki AC firmy Cytiva są dostarczane w postaci gotowej do użycia. Dekantacja fizyn, które mogłyby zatkać kolumnę, nie jest konieczna.

Unikaj używania mieszadeł magnetycznych, ponieważ mogą one uszkodzić matrycę chromatograficzną.

4. Oszacuj wymaganą ilość zawiesiny (ponownie zawieszonego medium) na podstawie zaleceń zawartych w instrukcji obsługi.
5. Wlej wymaganą objętość zawiesiny do kolumny. Nalewanie za pomocą szklanego pręta przyłożonego do ściany kolumny zminimalizuje wprowadzanie pęcherzyków powietrza.
6. Natychmiast napełnij kolumnę buforem.
7. Zamontuj górną część kolumny/adapter i podłącz do pompy.
8. Otwórz wylot kolumny i ustaw pompę na żądaną szybkość przepływu (na przykład 15 ml/min w kolumnie XK 16/20).

Gdy objętość zawiesiny jest większa niż całkowita objętość kolumny, podłącz drugą szklaną kolumnę, aby działała jako zbiornik (szczegółowe informacje znajdują się w części Informacje o zamawianiu). Zapewnia to, że zawiesina ma stałą średnicę podczas pakowania, minimalizując turbulencje i poprawiając warunki pakowania kolumny.

Jeśli nie można uzyskać zalecanej szybkości przepływu, należy użyć maksymalnej szybkości przepływu, jaką może zapewnić pompa.

9. Utrzymać szybkość przepływu pakowania przez co najmniej 3 CV po uzyskaniu stałej wysokości złoża. Zaznaczyć wysokość złoża na kolumnie.

Nie przekraczać 70% szybkości przepływu wypełnienia podczas oczyszczania.

10. Zatrzymać pompę i zamknąć wylot kolumny. Jeśli została użyta druga kolumna: Zdejmij górną część i ostrożnie wypełnij resztę kolumny buforem, aby utworzyć menisk u góry. Włóż adapter do kolumny pod kątem, upewniając się, że powietrze nie jest uwięzione pod siatką.
11. Przesuń adapter powoli w dół kolumny (wylot adaptera powinien być otwarty), aż do osiągnięcia znaku. Zablokuj adapter w odpowiedniej pozycji.
12. Podłącz kolumnę do pompy i rozpocznij wyrównywanie. W razie potrzeby zmień położenie adaptera.

Podłoże musi zostać dokładnie wypłukane w celu usunięcia roztworu do przechowywania, zwykle 20% etanolu. Pozostałości etanolu mogą zakłócać kolejne procedury.

Wiele pożywek chromatograficznych wyrównanych sterylną solą fizjologiczną buforowaną fosforanem zawierającą środek przeciwdrobnoustrojowy może być przechowywanych w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca, ale zawsze należy postępować zgodnie ze szczegółowymi instrukcjami przechowywania dostarczonymi z produktem.

Pakowanie i wydajność kolumny

Wydajność kolumny wyrażana jest jako liczba płytek teoretycznych na metr złoża chromatograficznego (N) lub jako H (wysokość równoważna płytce teoretycznej, HETP), która jest długością złoża (L) podzieloną przez liczbę płytek. Wydajność kolumny jest związana z poszerzeniem pasma, które może wystąpić na kolumnie i może być obliczona z wyrażenia:

N = 5.54 × (

VR -- Wh

)2

V_R = objętość eluowana od początku nanoszenia próbki do maksimum piku
w_h = szerokość piku mierzona jako szerokość zarejestrowanego piku w połowie wysokości piku

H oblicza się z wyrażenia:

H =

L N

L = wysokość upakowanego złoża.

Pomiary V_R i w_h mogą być wykonane w odległości (mm) lub objętości (ml), ale oba parametry muszą być wyrażone w tej samej jednostce.

Wydajność kolumny powinna być sprawdzana w regularnych odstępach czasu poprzez wstrzykiwanie acetonu w celu określenia wydajności kolumny (N) i symetrii piku (współczynnik asymetrii, A_s). Ponieważ obserwowana wartość N zależy od czynników eksperymentalnych, takich jak szybkość przepływu i obciążenie próbki, porównania należy przeprowadzać w identycznych warunkach. W AC wydajność jest mierzona w warunkach izokratycznych poprzez wstrzyknięcie acetonu (który nie wchodzi w interakcje z medium) i pomiar eluowanego piku, jak pokazano na Rysunku A6.2.

.

Rysunek A6.2. Pomiary wykonane w celu obliczenia wydajności kolumny.

Zgodnie z ogólną zasadą, dobra wartość H jest około dwa do trzech razy większa od średniej średnicy cząstek pakowanego medium. Dla cząstek o wielkości 90 µm oznacza to wartość H od 0,018 do 0,027 cm.

Współczynnik asymetrii (A_s) jest wyrażony jako:

.As =

b a

gdzie

a = szerokość pierwszej połowy piku przy 10% wysokości piku
b = szerokość drugiej połowy piku przy 10% wysokości piku

A_s powinna być jak najbliższa 1.0. Rozsądna wartość A_s dla krótkiej kolumny używanej w AC wynosi od 0,80 do 1,80.

Rozległa krawędź wiodąca jest zwykle oznaką, że medium jest upakowane zbyt ciasno, a rozległy ogon jest zwykle oznaką, że medium jest upakowane zbyt luźno.

Przeprowadź co najmniej 2 CV buforu przez nowo zapakowaną kolumnę, aby upewnić się, że medium jest wyrównane z buforem startowym.

Pakowanie kolumn na zamówienie

Usługa pakowania kolumn laboratoryjnych lub wypełniania 96-dołkowych płytek jest świadczona, gdy kolumny lub płytki z odpowiednimi mediami chromatograficznymi nie są dostępne w standardowym portfolio. Grupa produktów niestandardowych ściśle współpracuje z klientem w celu dostarczenia zapakowanych kolumn spełniających specjalistyczne wymagania w zakresie oczyszczania.