Test enzymatyczny rybonukleazy A (EC 3.1.27.5)

Opis

Ta procedura może być stosowana do oznaczania aktywności rybonukleazy A (RNazy A). Spektrofotometryczne oznaczenie szybkości zatrzymania [absorbancja przy 300 nm (A₃₀₀), droga światła = 1 cm] opiera się na następującej reakcji:

RNaza A
Kwas rybonukleinowy + woda -----------> Oligonukleotydy

Definicja jednostki: Jedna jednostka aktywności rybonukleazy A spowoduje spadek o 100% na minutę wartości E₀ - E_f przy pH 5,0 w temperaturze 25 °C.

Środki ostrożności

W celu uzyskania informacji dotyczących zagrożeń i bezpiecznego obchodzenia się z produktem należy zapoznać się z kartą charakterystyki.

Wymagane odczynniki i sprzęt

Octan sodu, trójwodny (Nr prod. Nr S8625)
Kwas rybonukleinowy (Nr prod. Nr prod.R6750)

.Instrukcje przygotowania

Do przygotowania odczynników należy używać ultraczystej wody (oporność ≥18 MΩxcm w temperaturze 25 °C).

Bufor (100 mM octan sodu, pH 5,0 w 25 °C) - Przygotuj roztwór o stężeniu 13,61 mg/ml przy użyciu trójwodzianu octanu sodu (nr prod. Nr S8625) w ultraczystej wodzie. Dostosuj pH do 5,0 w 25 ° C za pomocą 2 M kwasu octowego.

RNA Solution [0,1% (w/v) Ribonucleic Acid Solution] - Przygotuj roztwór ~ 1 mg / ml w buforze przy użyciu kwasu rybonukleinowego (nr prod. Nr R6750). Zapewnić rozpuszczenie przez wirowanie lub odwracanie. Nie nie używać mieszadła. Rozpuszczanie może trwać do 30 minut. Po rozpuszczeniu RNA, stężenie RNA musi zostać zweryfikowane przed przeprowadzeniem testu. Odmierzyć pipetą następujące ilości do jednorazowych kuwet akrylowych o pojemności 3,0 ml i wymieszać przez odwrócenie:

Odczynnik	Substrat (mL)	Blank (mL)
RNA Solution	1.50	-
Woda ultraczysta	1.50	1.50
Bufor	-	1.50

Wyznaczyć ΔA₃₀₀ Substrat = A₃₀₀ Substrat - A₃₀₀ Blank. ΔA₃₀₀ Substrat musi wynosić 0,73±0,025. Jeśli to konieczne, dostosuj absorbancję używając odpowiedniej ilości buforu lub stałego kwasu rybonukleinowego.

Roztwór enzymu (roztwór RNazy) - Przygotuj roztwór podstawowy RNazy zawierający 50-75 jednostek Kunitza/ml w zimnej ultraczystej wodzie.

• Dla oznaczenia całkowitej hydrolizy (E_f) - Przygotuj roztwór przez rozcieńczenie roztworu podstawowego RNazy zimną ultraczystą wodą do końcowego stężenia 0,50-0,75 jednostki Kunitza/ml.
• Dla określenia szybkości (E₀) - Bezpośrednio przed użyciem, przygotuj roztwór rozcieńczając roztwór podstawowy RNazy zimną ultraczystą wodą do końcowego stężenia 0,20-0,30 jednostki Kunitza/ml.

Procedura

Oznaczanie całkowitej hydrolizy (E_f)

W mieszaninie reakcyjnej 3.00 ml mieszaniny reakcyjnej, końcowe stężenie wynosi 50 mM octanu sodu, 0,05% (w/v) RNA i 0,75-1,13 jednostki (jednostek) Kunitza RNazy A.

1. Odmierzyć pipetą następujące składniki do akrylowych kuwet jednorazowych o pojemności 3,0 ml. Przygotować test w trzech egzemplarzach. Wymieszać przez odwrócenie.

Odczynnik	Test (mL)	Puste (mL)
RNA Roztwór	1.	Blank (mL)
RNA Solution	1.50	-
Roztwór enzymu	1.50	-
Woda ultraczysta	-	1.50
Bufor	-	1.50

2. Wyrównać odpowiednio termostatowany spektrofotometr do temperatury 25°C. Wyzerować spektrofotometr za pomocą kuwety Blank.

3. Monitorować absorbancję przy A₃₀₀ kuwet testowych przez ~120 minut w odstępach 1-minutowych lub do momentu, gdy ΔA₃₀₀/min wyniesie ≤0,002. Gdy szybkość zostanie utrzymana przez 5 minut, całkowita hydroliza jest zakończona.

4. Końcowe odczyty absorbancji dla trzech testów muszą być zgodne w 90%.

Określanie szybkości (E₀)

W mieszaninie reakcyjnej o objętości 3,00 ml końcowe stężenie wynosi 50 mM octanu sodu, 0,05% (w/v) RNA i 0.04-0,06 jednostki Kunitza RNazy A.

1. Przy spektrofotometrze ustawionym na 25 °C, wyzeruj urządzenie używając kuwety Blank , przygotowanej zgodnie z Total Hydrolysis Determination (E_f), krok 1.

2. Odmierzyć pipetą do jednorazowych kuwet akrylanowych o pojemności 3,0 ml następujące składniki:

Odczynnik	Test 1 (mL)	Test 2 (mL)	Test 3 (mL)
RNA Roztwór	1. (mL)	Test 3 (mL)
RNA Solution	1.50	1.50	1.50
Woda ultraczysta	1.30	1.35	1.40

3. Wymieszać przez odwrócenie i wyrównać do 25 °C w spektrofotometrze.

4. Następnie dodać:

3.

Odczynnik	Test 1 (mL)	Test 2 (mL)	Test 3 (mL)
Roztwór enzymu	0.20	0,15	0,10

5. Natychmiast wymieszać przez odwrócenie i rejestrować spadek A₃₀₀ przez co najmniej 10 minut w odstępach 1-minutowych.

Oznaczanie zanieczyszczenia substratu

1. Odmierzyć pipetą następujące ilości do jednorazowych kuwet akrylowych o pojemności 3,0 ml i wymieszać przez odwrócenie:

Oznaczanie zanieczyszczenia substratu

1.

Odczynnik	Substrat (mL)	Blank (mL)
RNA Solution	1.50	-
Woda ultraczysta	1.50	1.50
Bufor	-	1.50

2. Wyznaczyć ΔA₃₀₀ Substrat = A₃₀₀ Substrat - A₃₀₀ Blank.

3. Wartość ΔA₃₀₀ Substratu musi mieścić się w zakresie 20% wartości znalezionej w Weryfikacji Stężenia RNA, patrz Instrukcje przygotowania, Roztwór RNA, aby test był ważny. Różnice >20% wskazują na zanieczyszczenie substratu RNA. 

Wyniki

Obliczenia

1.

Wykreślić wykres ln(E₀ - E_f) w funkcji czasu (minuty) i określić nachylenie linii.

Nachylenie =	Δln(E0 - Ef)
	Δt

2.

Jednostki Kunitza/mL enzymu =	-(nachylenie) (3) (df)
	(mL enzymu)

gdzie:
3 = Całkowita objętość testu (w mL)
df = Współczynnik rozcieńczenia
mL enzymu = Objętość roztworu enzymu dodana w określaniu szybkości (E₀), krok 4

3.

Jednostki Kunitza/mg stałe =	jednostki Kunitza/mL enzymu
	mg solid/mL enzymu

.

Referencje

1. Kunitz M. 1946. A spectrophotometric method for the measurement of ribonuclease activity . Journal of Biological Chemistry. 164(2):563-8.