Test dietanoloaminowy do testu enzymatycznego fosfatazy alkalicznej (EC 3.1.3.1)
1. Cel
Standaryzacja procedury enzymatycznego oznaczania fosfatazy alkalicznej, oznaczanie dietanoloaminy.
2. Zakres
2.1 Niniejsza procedura ma zastosowanie do wszystkich produktów, które mają specyfikację dla fosfatazy alkalicznej wykorzystującej system oznaczania dietanoloaminy.
2.2 Ten test enzymatyczny nie może być stosowany do oznaczania fosfatazy alkalicznej, w której aktywność właściwa jest podawana tylko w jednostkach glicyny.
3. Definicje
3.1 Woda oczyszczona - woda z systemu dejonizującego, oporność ~18MΩּcm @25 °C
3.2 Definicja jednostki - jedna jednostka DEA hydrolizuje 1,0 µMol fosforanu p-nitrofenylu na minutę przy pH 9,8 w temperaturze 37 °C.
3.2 Pi - nieorganiczny fosforan
4. Dyskusja
fosforan p-nitrofenylu + H2O Fosfataza alkaliczna > p-Nitrofenol + Pi
5. Obowiązki
Wszyscy przeszkoleni pracownicy działu analitycznego są odpowiedzialni za przestrzeganie niniejszego protokołu zgodnie z jego treścią.
6. Bezpieczeństwo
Zwrócić uwagę na karty charakterystyki substancji niebezpiecznych (SDS) w celu zapoznania się z zagrożeniami i odpowiednimi środkami ostrożności.
7. Procedura
7.1 WARUNKI:
T = 37 °C, pH = 9,8, A750nm, ścieżka światła = 1 cm
7.2 METODA:
Ciągłe spektrofotometryczne oznaczanie szybkości
7.3 ODCZYNNIKI:
7.3.1 1,0 M bufor dietyloaminowy z 0,50 mM chlorkiem magnezu, pH 9.8 w 37 °C (Bufor)
Przygotuj roztwór o stężeniu 140 mg/mL w wodzie oczyszczonej przy użyciu dietanoloaminy, takiej jak numer produktu D8885. Dostosuj pH dietanoloaminy do 9,8 w 37 °C za pomocą 5 M HCl. Rozcieńczyć roztwór o dostosowanym pH do końcowego stężenia 105 mg/mL dietanoloaminy za pomocą oczyszczonej wody i dodać 0,5 ml/l 1M roztworu chlorku magnezu, takiego jak numer produktu M1028.
Przygotowywać na świeżo i chronić przed światłem.
7.3.2 0.67 M roztwór fosforanu p-nitrofenylu (PNPP)
Przygotuj roztwór o stężeniu 247 mg/ml w wodzie oczyszczonej przy użyciu substratu fosfatazy, takiego jak numer produktu P4744.Przygotowywać na świeżo i chronić przed światłem.
7.3.3 Roztwór enzymu fosfatazy alkalicznej (Enzym)
7.3.3.1 Bezpośrednio przed użyciem przygotować roztwór zawierający około 0.15 jednostek/ml fosfatazy alkalicznej w zimnym buforze.
7.3.3.2 W przypadku próbek płynnych, bezpośrednio przed użyciem przygotować stężony (2000 jednostek/ml lub więcej) roztwór podstawowy w zimnym buforze. Wykonaj kolejne rozcieńczenia, aby uzyskać końcowy roztwór zawierający około 0,15 jednostki/ml w zimnym buforze.
7.4 METODA TESTOWA:
7.4.1 Odpipetuj (w mililitrach) następujące odczynniki w następującej kolejności do odpowiedniej kuwety:
7.4.2 Wymieszać przez odwrócenie i wyrównać do 37 oC. Monitorować A405nm aż do uzyskania stałej wartości za pomocą termostatowanego spektrofotometru. Następnie dodać:
7.4.3 Natychmiast wymieszać przez odwrócenie i rejestrować wzrost A405nm przez około 5 minut. Uzyskać ΔA405nm / minutę przy użyciu maksymalnej szybkości liniowej zarówno dla testu, jak i ślepej próby, używając co najmniej czterech punktów danych w przedziale czasowym jednej minuty.
7.5 OBLICZENIA
| 7.5.1 | Units/mL enzyme = | (ΔA405nm/min Test - ΔA405nm/min Blank) (VF) |
| (18.5) (VE) |
| 7.5.2 | Units/mg solid = | jednostki/mL enzymu |
| mg stałe/mL enzymu |
| 7.5.3 | Jednostki/mg białka = | jednostki/mL enzymu | |
| mg stałe/mL enzymu |
7.5.4 VF = objętość (w mililitrach) oznaczenia
df = współczynnik rozcieńczenia
18.5 = milimolarny współczynnik ekstynkcji p-nitrofenolu przy 405 nm
VE = objętość (w mililitrach) użytego enzymu
7.6 KOŃCOWE STĘŻENIA ANALIZY
W mieszaninie reakcyjnej o objętości 3,00 ml końcowe stężenia wynoszą 983 mM dietanoloaminy, 0,49 mM chlorku magnezu, 11,2 mM fosforanu p-nitrofenylu i około 0,0075 jednostki fosfatazy alkalicznej.
8. Zatwierdzenie
Przegląd, zatwierdzenia i podpisy dla tego dokumentu zostaną wygenerowane elektronicznie przy użyciu EDMS. Wydrukuj kopię "Do użytku", jeśli wymagana jest kopia papierowa z weryfikacją podpisu.
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?