Test enzymatyczny kwaśnej fosfatazy (EC 3.1.3.2)

1. Cel

Standaryzacja procedury enzymatycznego oznaczania kwaśnej fosfatazy.

2. Zakres

Ta procedura ma zastosowanie do wszystkich produktów, które mają specyfikację dla kwaśnej fosfatazy.

3. Definicje

3.1  Woda oczyszczona - woda z systemu dejonizacyjnego, rezystywność > lub = 18MΩ-cm @ 25 ºC

3.2. Definicja jednostki - Jedna jednostka hydrolizuje 1,0 μmola fosforanu p-nitrofenylu na minutę przy pH 4,8 w temperaturze 37 °C.

4. Dyskusja

fosforan nitrofenylu + H₂O    ^{kwaśna fosfataza}   > p-Nitrofenol + P_i

5. Obowiązki

Personel służb analitycznych powinien postępować zgodnie z niniejszym protokołem.

6. Bezpieczeństwo

Odniesienie do karty charakterystyki substancji niebezpiecznej (SDS) w celu zapoznania się z zagrożeniami i odpowiednimi środkami ostrożności.

7. Procedura

7.1 WARUNKI:
T=37 °C, pH=4,8, A_410nm, ścieżka światła=1 cm

7.2 METODA:
Spektrofotometryczne oznaczanie szybkości zatrzymania

7.3 ODCZYNNIKI:

7.3.1     90 mM bufor cytrynianowy, pH 4,8 w 37 °C (bufor)
Przygotować roztwór o stężeniu 26,5 mg/ml w wodzie oczyszczonej, używając kwasu cytrynowego, trójsodowego, dwuwodnego, nr produktu C7254. Dostosować do pH 4,8 w 37 °C za pomocą 1 M NaOH/HCL.

7.3.2     15,2 mM fosforanu p-nitrofenylu (PNPP)
Przygotować roztwór 5,64 mg / ml w wodzie oczyszczonej przy użyciu fosforanu p-nitrofenylu.

7.3.3     100 mM roztwór wodorotlenku sodu (NaOH)
Przygotuj 200 mL przez rozcieńczenie 20 mL 1,0 N wodorotlenku sodu, nr produktu. S2567 w wodzie oczyszczonej, używając kolby pomiarowej o pojemności 200 ml.

7.3.4   Roztwór enzymu kwaśnej fosfatazy (Enzym)
Bezpośrednio przed użyciem przygotować roztwór zawierający 0,15-0,25 un/mL kwaśnej fosfatazy w zimnej oczyszczonej wodzie.

7.4 METODA BADAWCZA

7.4.

7.4.1 Odmierzyć pipetą (w mililitrach) następujące odczynniki do odpowiednich pojemników:

	Test	Blank
Odczynnik 7.3.1 (Bufor)	0.50	0.50
Odczynnik 7.3.2 (PNPP)	0.50	0.50

7.4.2 Wymieszać przez odwrócenie i wyrównać do 37 oC. Następnie dodać:

Odczynnik 7.3.4 (Enzym)

0.10

----

7.4.3 Natychmiast wymieszać przez odwrócenie i inkubować w temperaturze 37 oC przez dokładnie 10 minut. Następnie dodać:

Odczynnik 7.3.3 (NaOH)	4.00	4.00
Odczynnik 7.3.4 (Enzym)	-----	0.10

7.4.4    Wymieszać przez odwrócenie i za pomocą odpowiedniego spektrofotometru zarejestrować absorbancję przy 410 nm zarówno dla testu, jak i dla próby ślepej.

7.5 OBLICZENIA

7.5.1	Units/mL enzyme  =	ΔA410nm Test - ΔA410nm Blank)*(5.1)*(df)
		(10)*(18.3)*(0.1)

 

gdzie:
     5.1 = całkowita objętość (w mililitrach) roztworu
    df = współczynnik rozcieńczenia
  df = współczynnik rozcieńczenia.nbsp;  10 = Czas oznaczania (w mililitrach) zgodnie z definicją jednostki
    18.3 = milimolarny współczynnik ekstynkcji p-nitrofenolu
    0.1 = Objętość (w mililitrach) użytego enzymu

7.5.2	Units/mg solid =	jednostki/mL enzymu
		mg solid/mL enzymu

 

7.5.3	Units/mg solid =	jednostki/mL enzymu
		mg solid/mL enzymu

 

7.6   KOŃCOWE STĘŻENIE ANALIZY
W mieszaninie reakcyjnej o objętości 1,10 ml końcowe stężenia wynoszą 41 mM kwasu cytrynowego, 6,9 mM fosforanu p-nitrofenylu i 0,015-0,025 jednostek kwaśnej fosfatazy.

Odniesienie

1. Bergmeyer H, Gawehn K, Grassl M. 1974. Methods of Enzymatic Analysis. Volume I, 2nd ed.. New York, NY: Academic Press, Inc..