Test enzymatyczny proteinazy K

Opis testu aktywności proteinazy K (EC 3.4.21.64)

Ta procedura służy do oznaczania aktywności proteinazy K (EC 3.4.21.64) przy użyciu hemoglobiny jako substratu.

Uwaga: Ten test nie służy do pomiaru aktywności unieruchomionych produktów proteinazy K, takich jak produkty o numerach P9290 lub 82452.

Spektrofotometryczne oznaczenie szybkości zatrzymania (A₇₅₀, droga światła = 1 cm) opiera się na następującej reakcji:

Definicja jednostki: Jedna jednostka proteinazy K hydrolizuje hemoglobinę zdenaturowaną mocznikiem w celu wytworzenia barwy odpowiadającej 1,0 µmol tyrozyny na minutę przy pH 7,5 w temperaturze 37 °C (barwienie odczynnikiem Folin & Ciocalteu's Phenol Reagent).

Wymagane odczynniki do testu proteinazy K

• Fosforan potasu, jednozasadowy (P5379)
• Hemoglobina z krwi bydlęcej (H2625)
• 1 M roztwór NaOH
• Mocznik (U1250))
• Dwuwodny chlorek wapnia (C3881)
• 6.1 N roztwór kwasu trichlorooctowego (T0699)
• 2.0 N Folin & Ciocalteu's Phenol Reagent (F9252)
• L-Tyrozyna (T3754)
• 1.0 M kwas solny (H9892)

Przygotowanie odczynników do testu proteinazy K

Do przygotowania odczynników używaj ultraczystej wody (oporność ≥18 MΩxcm w 25 °C).

Bufor  (1,0 M bufor fosforanu potasu, pH 7,5 w 37 °C) - Przygotuj 136 mg/ml roztwór jednozasadowego fosforanu potasu (P5379) w wodzie ultraczystej. Dostosuj pH do 7,5 w temperaturze 37 °C za pomocą 1 M do 10 M KOH.

Substrat [100 mM fosforan potasu, pH 7,5 w 37 °C z 2.0% (w/v) hemoglobiny i 6 M mocznika] - Aby przygotować 100 ml roztworu substratu, dodaj 2,0 g hemoglobiny z krwi bydlęcej (H2625) do ~40 ml ultraczystej wody. Pozostawić hemoglobinę do rozpuszczenia, mieszając w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Dodać 8,0 ml 1 M roztworu NaOH i mieszać przez kolejne 20 minut w temperaturze 37 °C. Dodaj 36,0 g mocznika (U1250) i kontynuuj mieszanie w temperaturze 37 °C przez 60 minut. Dodaj 10 ml buforu i dostosuj pH do 7,5 w temperaturze 37 °C za pomocą 1 M do 5 M HCl. Dostosuj końcową objętość do 100 ml za pomocą ultraczystej wody.

Enzyme Diluent (20 mM CaCl₂ Solution) - Przygotuj 2.95 mg/ml roztworu dwuwodnego chlorku wapnia (C3881) w ultraczystej wodzie.

Roztwór TCA  (305 mM [5% (w/v)] kwas trichlorooctowy) - Rozcieńczyć 6.1 N [~100% (w/v)] roztwór kwasu trichlorooctowego (T0699) 20-krotnie wodą ultraczystą.

0,5 M roztwór NaOH - Rozcieńczyć 1.0 M roztwór wodorotlenku sodu dwukrotnie wodą ultraczystą.

F&C Reagent (1 N Folin & Ciocalteu's Phenol Reagent) - Rozcieńczyć 2.0 N Folin & Ciocalteu's Phenol Reagent (F9252) dwukrotnie wodą ultraczystą.

Roztwór wzorcowy tyrozyny (1.1 mM roztwór wzorcowy L-tyrozyny) - Odważyć 20 mg L-tyrozyny (T3754) na mikrowadze i przenieść do kolby miarowej klasy A o pojemności 100 ml. Dodać ~80 ml ultraczystej wody. Delikatnie podgrzać do temperatury 70-80°C (nie gotować), aż tyrozyna się rozpuści. Schłodzić do temperatury pokojowej. Dostosować do znaku objętości za pomocą ultraczystej wody.

Uwaga: Roztwór standardowy Tyr jest stabilny przez 6 miesięcy. Przechowywać w lodówce.

200 mM HCl Solution - Pięciokrotnie rozcieńczyć 1,0 M kwas solny wodą ultraczystą.

Roztwór enzymu (proteinazy K) - Bezpośrednio przed użyciem przygotować roztwór zawierający 0.075-0,175 jednostki/ml proteinazy K w zimnym (2-8 °C) 20 mM roztworze CaCl₂ 

.

Procedura testu proteinazy K

1. Odmierzyć pipetą substrat do odpowiednich fiolek.

Odczynnik	Test 1 (mL)	Test 2 (mL)	Puste (mL)
Substrat	2.	Test 3 (mL)	Puste (mL)
Substrat	2.50	2.50	2.50	2.50

2. Wyrównać temperaturę do 37 °C przez około 10 minut, a następnie dodać następujące składniki:

Odczynnik	Test 1 (mL)	Test 2 (mL)	Test 3 (mL)	Puste (mL)
Roztwór TCA	-	-	-	-
Roztwór enzymu	0.50	0.50	0.50	-

3. Wymieszać przez wirowanie, inkubować w temperaturze 37 °C przez dokładnie 10 minut, a następnie dodać następujące składniki:

Odczynnik	Test 1 (mL)	Test 2 (mL)	Test 3 (mL)	Puste (mL)
Roztwór TCA	5.00	5.00	5.00	5.00
Roztwór enzymatyczny	-	-	-	0.50

4.     Wymieszać przez wirowanie i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.

5.     Sklaruj każdy roztwór filtrując przez filtr 0,45 µM.

6.     Dodaj następujące składniki w odpowiednich fiolkach:

6.

Odczynnik	Test 1 (mL)	Test 2 (mL)	Test 3 (mL)	Puste (mL)
Filtrat z kroku 5	2.50	2.50	2.50	2.50
0.5 M roztwór NaOH	5.00	5.00	5.00	5.00

7.     Zakorkować fiolki i dokładnie wymieszać każdy test i próbę ślepą, mieszając.

8.Przygotuj serię wzorców, pipetując (w mililitrach) następujące odczynniki do odpowiednich fiolek:

8.

Odczynnik	Std 1	Std 2	Std 3	Std 4	Std 5	Blank
Tyr Standard Solution	0.05	0.10	0.30	0.50	0.70	-
200 mM roztwór HCl	2.45	2.40	2.20	2.00	1.80	2.50
0,5 M roztwór NaOH	5.00	5.00	5.00	5.00	5.00	5.00

Uwaga: Objętości wzorców mogą być modyfikowane lub dodawane w razie potrzeby.

9. Dokładnie wymieszaj każdy standard i standardową próbę ślepą, mieszając.

10.  Dodaj 1,50 ml odczynnika F&C do wszystkich testów, standardów i prób ślepych. Zamknąć fiolki, natychmiast dokładnie wymieszać przez wirowanie lub worteksowanie i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

11.  Wyzerować odpowiedni termostatowany spektrofotometr względem powietrza. Przenieś każdy roztwór do odpowiedniej kuwety i zmierz absorbancję przy 750 nm.

Uwaga: Jeśli roztwory są zamglone, przefiltruj przez filtr 0.45 µM bezpośrednio przed pomiarem absorbancji.

Obliczyć wynik testu

Obliczenia

1. Krzywa wzorcowa

Dla każdego wzorca obliczyć ΔA₇₅₀ Wzorzec:

ΔA₇₅₀ Standard = A₇₅₀ Standard - A₇₅₀ Standard Blank

Oblicz dla każdego wzorca krzywą standardową./p>

Wykreślić krzywą wzorcową ΔA₇₅₀ Standard dla wzorców względem mikromoli tyrozyny przy użyciu regresji liniowej. Wartość R-kwadrat musi wynosić ≥0,99, aby wyniki były prawidłowe.

2. Określenie testu

Dla każdego testu oblicz ΔA₇₅₀ Test:

ΔA₇₅₀ Test = A₇₅₀ Test - A₇₅₀ Test./sub> Ślepa próba

Na podstawie krzywej standardowej określ mikromole równoważników tyrozyny uwolnionych w teście.

Jednostki/mL enzymu =	(µmol uwolnionych równoważników tyrozyny) (8.0) (df)
	(0.5) (10) (2.5)

gdzie:

8.0 = objętość (mL) całkowitej zatrzymanej reakcji

df = współczynnik rozcieńczenia

0.50 = mL dodanego roztworu enzymu

10 = czas inkubacji testu (minuty)

2,5 = objętość (mL) przesączu użytego do oznaczenia kolorymetrycznego

3.

3.

Units/mg solid =	jednostka/mL enzymu
	mg solid/mL enzymu

Referencje

1. Folin O, Ciocalteu V. 1927. On tyrosine and tryptophane determinations in proteins.. J Biol Chem. 73(2):627-650.

03/17-1