Test enzymatyczny inwertazy

1. Cel

Standaryzacja procedury enzymatycznego oznaczania inwertazy.

2. Zakres

Niniejsza procedura ma zastosowanie do wszystkich produktów, które mają specyfikację dla aktywności enzymatycznej inwertazy.

3. Definicje

3.1. Woda oczyszczona - woda z systemu dejonizacyjnego, oporność ~ 18MΩ-cm @ 25 ºC

3.2. Definicja jednostki - Jedna jednostka hydrolizuje 1,0 μmol sacharozy do cukru inwertowanego na minutę przy pH 4,5 w temperaturze 55°C

4. Dyskusja

Sacharoza + H₂O    ^Inwertaza   > Glukoza + Fruktoza
Zarówno glukoza, jak i fruktoza są wykrywane jako cukry redukujące.

5. Obowiązki

Personel służb analitycznych powinien postępować zgodnie z niniejszą procedurą.

6. Bezpieczeństwo

Zwrócić uwagę na kartę charakterystyki substancji niebezpiecznej (SDS) w celu zapoznania się z zagrożeniami i odpowiednimi środkami ostrożności.

7. Procedura

7.1. WARUNKI: T = 55 ºC, Abs₄₁₀, pH = 4,5, Droga światła= 1cm

7.2 METODA:
Spektrofotometryczna reakcja zatrzymania

7.3 ODCZYNNIKI

7.3.1.   100 mM octan sodu, pH 4,5 w temperaturze 55°C (BUFOR) 
Przygotować 13.6 mg/ml roztworu trihydratu octanu sodu (nr produktu S8625) w wodzie oczyszczonej. Dostosować pH do 55 ºC za pomocą 1 M HCl.

7.3.2.   1.0% w/v Sucrose Substrate (SUCROSE) 
Przygotować 10 mg/ml roztwór sacharozy (nr produktu S7903) w odczynniku 7.3.1. Przygotuj świeży roztwór.

7.3.3.  Inwertaza (ENZYME) 
Bezpośrednio przed użyciem przygotuj roztwór zawierający 0.3 - 0,4 jednostki/ml Inwertazy w zimnej oczyszczonej wodzie. Sugestia: W celu zwiększenia rozpuszczalności próbki odważyć produkt do wig-l-bug i odpowiednio rozcieńczyć.

7.3.4.   0.5 M NaOH (NaOH) 
Przygotować rozcieńczenie 1:2 1 N NaOH  (Nr produktu S2567) w oczyszczonej wodzie.

7.3.5.   0,5% w/v PAHBAH (PAHBAH) 
Przygotować 5 mg/ml roztwór p-hydroksybenzhydrazydu (Nr produktu. H9882) w odczynniku 7.3.4. Przygotować świeży.

7.3.6.   Roztwór wzorcowy glukozy o stężeniu 5,56 mM (STD SOLN) 
Przygotować roztwór wzorcowy glukozy o stężeniu 1,0 mg/ml (nr produktu. G8270) w wodzie oczyszczonej.

7.4 Metoda badania

7.4.1.   Odmierzyć pipetą następujące ilości, w mililitrach, do odpowiednich pojemników:

.

	Test Blank	Test	Std Blank	Std 1	Std 2	Std 3	Std 4	Std 5	Std 6
Woda oczyszczona	0.10	---	1.00	0.95	0.90	0.80	0.70	0.60	0.50
Odczynnik 7.3.2 (SUCROSE)	0.90	0.90	---	---	---	---	---	---	---
Odczynnik 7.3.6 (STD SOLN)	---	---	---	0.05	0.10	0.20	0.30	0.40	0.50

7.4.2.   Wymieszać przez wirowanie i wyrównać do 55 ºC. Następnie dodać:

	Test Blank	Test	Std Blank	Std.u>Std 1	Std 2	Std 3	<Std 4	Std 5	Std 6
Reagent 7.3.3 (ENZYME)	---	0.10	---	---	---	---	---	---	---

7.4.3.   Wymieszać przez wirowanie i inkubować w temperaturze 55 °C przez dokładnie 20 minut. Zawirować i odwrócić probówki po 20-minutowej inkubacji.

7.4.4.   Pobrać 0,10 ml z każdej mieszaniny reakcyjnej i umieścić w oddzielnych probówkach zawierających:

	Test Blank	Test	Std Blank	Std.u>Std 1	Std 2	Std 3	<Std 4	Std 5	Std 6
Odczynnik 7.3.5 (PAHBAH)	2.90	2.90	2.90	2.90	2.90	2.90	2.90	2.90	2.90

7.4.5.   Natychmiast wymieszać przez wirowanie. Umieścić marmurowy lub wentylowany korek na każdej probówce i umieścić we wrzącej łaźni wodnej.

7.4.6.   Gotować probówki przez 5 minut. Probówki można gotować razem w ciągu 15 minut od zatrzymania reakcji.

7.4.7.   Wyjąć z wrzącej łaźni wodnej i schłodzić do temperatury pokojowej.

7.4.8.   Wymieszać przez wirowanie i przenieść roztwór do odpowiednich kuwet. Zmierzyć absorbancję przy 410 nm dla wszystkich mieszanin reakcyjnych za pomocą odpowiedniego spektrofotometru.

7.5 OBLICZENIA

7.5.1.   Krzywa wzorcowa:

Skorygowana absorbancja: ΔA_410nm Std = A_410nm Std - A_410nm Std Blank

Przygotować krzywą wzorcową, wykreślając ΔA_410nm Std względem μmoli glukozy.

7.5.2.   Skorygowana ΔA_410nm Test = A_410nm Test - A₄₁₀nm Próba ślepa

7.5.2.

7.5.3.	µmole uwolnionej glukozy =	(ΔA410nm/ Test - (y - intercept)
		(slope)

7.5.4.	Jednostki/mL enzymu=	(µmole glukozy)(df)
		(20)(0.1)(2)

gdzie:
  df = współczynnik rozcieńczenia
   20 = czas (w minutach) oznaczenia
   0.1 = objętość (w mililitrach) użytego enzymu
   2 = współczynnik konwersji dla 1 μmola sacharozy hydrolizowanej do glukozy i fruktozy

.

7.5.5.	Units/mg solid =	Units/mL enzyme
		mg solid/mL enzyme

.

7.5.6.	Units/mg protein =	Units/mg Solid
		mg protein/mg Solid

.

7.5.7.   Końcowe stężenia testu:
W mieszaninie reakcyjnej o objętości 1,00 ml końcowe stężenia wynoszą 90 mM octanu sodu, 0,90% (w/v) sacharozy i 0,03 - 0,04 jednostki inwertazy.