Przewodnik krok po kroku dla zestawu KitAlysis™ do badań przesiewowych reakcji krzyżowego sprzęgania Suzuki-Miyaura

Czytaj więcej

• Wymagane materiały - konfiguracja
• Procedura konfiguracji.
• Procedura konfiguracji i analiza
• Dodatkowe wskazówki

1 zasada  (K₃PO₄, 1.5 M roztwór w odgazowanej wodzie)
4 odgazowane rozpuszczalniki (DMAc, toluen, n-butanol i THF)
6 wstępnie zważonych katalizatorów (x4)

Wymagane materiały - konfiguracja

• 1 woreczek mylarowy z KitAlysis Zestawu do przesiewania reakcji Suzuki-Miyaura i będziesz używać następujących komponentów
  - 6 x 4 wstępnie zważone katalizatory w szklanych fiolkach z mieszadłami i matą zamykającą
  - 4 puste fiolki po 4 ml roztworu podstawowego substratu
• 1 NOWA KitAlysis 24-dołkowa folia zastępcza bloku reakcyjnego<
• 1 (2 ml) ampułka każda toluenu, THF, n- butanolu, DMAc i aq. 1.5 M K₃PO₄ (w pudełkach z ampułkami)
• 4 NOWE pręty mieszające<
• KitAlysis 24-dołkowy blok reakcyjny (sprzedawany oddzielnie)
• KitAlysis Benchtop Inertion Box (sprzedawany oddzielnie) lub pudełko na rękawiczki/torba na rękawiczki
• KitAlysis Torque Screwdriver Set (sprzedawany oddzielnie)

Dodatkowe (niedołączone) potrzebne elementy:

• .Pipeta (0-100 µL) & końcówki
• 4 (1 mL) strzykawki z długimi igłami
• Twój (het)arylowy halogenek i (het)arylowy boronian
• Nitrogen (lub Argon): z linii wyciągowej lub zbiornika
• 1 płyta grzejna z możliwością mieszania
• 1 płyta mieszająca (lub płyta grzejna do użycia bez ogrzewania)
• Fiolki HPLC, 96-dołkowy blok automatycznego próbnika HPLC lub płytki TLC

Set-Up Procedure

• Podgrzej gorącą płytkę do 60°C (użyj łaźni olejowej lub drugiego bloku reakcyjnego, aby utrzymać temperaturę i uniknąć pikowania). Temperatury reakcji Suzuki-Miyaura mogą wahać się od temperatury pokojowej do 120 °C, ale 60 °C jest ogólnym i bardzo dobrym punktem wyjścia.
• Umieść  NOWY KitAlysis 24-dołkową folię zastępczą bloku reakcyjnego na pokrywie bloku reakcyjnego (upewnij się, że wszystkie otwory, w tym otwór sondy temperatury, pokrywają się z odpowiednimi otworami w folii).
• Sprawdź wszystkie śruby, aby upewnić się, że nie są zerwane. Wymień wszystkie zerwane śruby na dostarczone zamienniki.
• Umieść KitAlysis Benchtop Inertion Box z rurką podłączoną do gazu obojętnego na drugiej,  nieogrzewanej płytce mieszającej  (patrz konfiguracja KitAlysis Benchtop Inertion Box w celu uzyskania szczegółowych informacji).
• Umieść KitAlysis 24-dołkowy blok reakcyjny z pokrywką w KitAlysis Benchtop Inertion Box. Rozpocząć przepływ azotu i przeciągnąć 5 minut. Pozostawić przepływ azotu do końca konfiguracji.
• Odważyć oba substraty bezpośrednio do wszystkich pustych fiolek reakcyjnych o pojemności 4 ml zgodnie z recepturą (dostarczoną w plik Excela do pobrania) dodawanie rozpuszczalnika i roztworu podstawowego. Dodaj jedno mieszadło do każdej fiolki z mieszaniną. Oznacz jako "DMAc mieszanina substratów A", "Toluene mieszanina substratów B", "n-butanol mieszanina substratów C" i "THF mieszanina substratów D").
• Częściowo otwórz pokrywę na KitAlysis Benchtop Inertion Box. Umieść "DMAc Substrate Mixture A" i "Toluene Substrate Mixture B" w dwóch otworach znajdujących się po lewej stronie tacy dyfuzora Inertion Box. Umieść "n-butanol Substrate Mixture C" i "THF Substrate Mixture D" w dwóch otworach po prawej stronie płytki. Upewnij się, że jedna fiolka jest umieszczona w środkowym otworze po obu stronach. Takie umieszczenie fiolki pozwala na najlepszy przepływ gazu obojętnego (zdejmij pokrywki z mieszanin stałych przed umieszczeniem ich w zalecanych otworach, zachowując pokrywki w pudełku do późniejszego użycia w razie potrzeby).
• Przenieś 24-fiolkowe, wstępnie załadowane katalizatory w nakrętkach do bloku reakcyjnego, upewniając się, że są one załadowane zgodnie z pasującym schematem (A1: lewy górny róg) na opakowaniu i bloku reakcyjnym. Pozostaw matę na pokrywie.
• Używając krakera do ampułek, otwórz po 1 ampułce  DMAc, Toluenu, n-butanolu i THF i szybko umieść w otworach ampułek znajdujących się wzdłuż dna Inertion Box, poniżej bloku reakcyjnego. Następnie otwórz 1 ampułkę roztworu bazowego i umieść ją w pozostałym otworze po obu stronach płytki.
• Gdy wszystkie składniki znajdą się w KitAlysis Benchtop Inertion Box, zamknij pokrywę i odkurzaj przez dodatkowe 5 minut. Pozostaw przepływający azot do końca konfiguracji.
• Oczyść igłę i strzykawkę w otworze dyfuzora azotu 2x, pociągając, a następnie popychając tłok. Używając oczyszczonej igły i strzykawki, dodaj wymagane ilości rozpuszczalnika do otwartych fiolek z mieszaniną substratów. Nie dodawaj roztworu podstawowego do żadnej mieszaniny substratów - jest on dodawany bezpośrednio do każdej z 24 fiolek reakcyjnych jako ostatni krok.
• Mieszaj mieszaniny aż do uzyskania roztworu (1-2 min). W przypadku zawiesin, patrz "dodatkowe wskazówki" poniżej.
• Podczas mieszania mieszanin, ostrożnie zdejmij matę zakrywającą z 24 fiolek, wstępnie załadowanych katalizatorów w bloku reakcyjnym.
• Dozować roztwory podstawowe (za każdym razem używając nowej końcówki pipety)
  
  • Dozować 100 µl   "DMAc Substrate Mixture A" do fiolek A1-A6 zgodnie z poniższym schematem.
  • Dozować 100 µL "mieszaniny substratów toluenu B" do fiolek B1-B6 zgodnie z poniższym schematem.
  • Dozować 100 µL "mieszaniny substratów butanolu C" do fiolek C1-C6 zgodnie z poniższym schematem.
  • Dozuj 100 µL i "THF Substrate Mixture D" do fiolek D1-D6 zgodnie z poniższym schematem.
    
    Może pozostać bardzo mała ilość nadmiaru roztworu dla każdej mieszaniny. Zachowaj go jako wzorzec reakcji dla HPLC/TLC później.
    
    
  • Dozuj 20 µL roztworu aq. 1.5 M K₃PO₄ mieszaniny roztworów do wszystkich fiolek A1-D6. Pomocne jest podawanie sobie lokalizacji fiolek w trakcie wykonywania zadania w celu śledzenia (A1, A2 itd.).

Rysunek 1. Instrukcje dawkowania dla DMAc, toluenu, n-butanolu, THF i K3PO4

• Po dozowaniu wszystkich mieszanin substratów i bazy zgodnie z recepturą, weź pokrywę  KitAlysis 24-Well Reaction Block i wyrównaj śruby z otworami w płytce.Upewnij się, że otwory sondy temperatury znajdują się w jednej linii zarówno na pokrywie, jak i na bloku.
• Przykręć pokrywę zgodnie ze wskazówkami i wzorem przedstawionym w sekcji "dodatkowe wskazówki" poniżej. Przed wyjęciem KitAlysis 24-dołkowego bloku reakcyjnego z pudełka, upewnij się, że pokrywa jest równomiernie uszczelniona na podstawie. Wykonaj tę wizualną kontrolę, aby uniknąć konieczności odkręcania pokrywy i ponownego przykręcania.
• Po całkowitym uszczelnieniu wyjmij KitAlysis 24-dołkowy blok reakcyjny z pudełka. Umieść na podgrzanej płycie grzejnej z sondą przez pokrywę i włożoną do bloku. Ogrzewać w temperaturze 60°C przez noc, mieszając z prędkością 300 obr. Wyższe lub niższe temperatury mogą być optymalne, ale 60 °C jest dobrym punktem wyjścia.
• Przygotuj roztwór gaszący / wzorzec wewnętrzny w butelce z wymienną pokrywką zgodnie z poniższym przepisem do analizy HPLC. Możliwa jest również analiza TLC.
• Po zakończeniu reakcji postępuj zgodnie z poniższą procedurą roboczą, aby wygasić reakcje, uczynić je bardziej odpowiednimi do analizy i dodać wzorzec wewnętrzny.

Roztwór wygaszający/wzorzec wewnętrzny

• 49 mL CH₃CN
• 1 mL AcOH
• 15.4 mg bifenylu (KitAlysis wzorzec wewnętrzny dostarczony w zestawie) W butelce znajduje się nadmiar, więc należy go zważyć.

Uwaga: Z tego przepisu uzyskuje się 50 ml roztworu podstawowego, który jest wystarczający dla wszystkich czterech zestawów przesiewowych w KitAlysis Suzuki-Miyaura Cross-Coupling Reaction Screening Kit. Ilość wzorca wewnętrznego wynosi 10 mol% na reakcję. Tak więc duży pik produktu do małego wzorca wewnętrznego wskazuje na dobrą reakcję.

Work-up Procedure and Analysis

• Cool Reaction Block. Zdejmij pokrywę za pomocą małego śrubokręta bez momentu obrotowego.
• Sprawdź każdą fiolkę pod kątem utraty rozpuszczalnika i zapisz.
• Dodaj 500 µL przygotowanego roztworu gaszącego do każdej fiolki za pomocą pipety.
• Założyć pokrywkę, dokręcić środkową śrubę i mieszać na płytce mieszającej (BEZ OGRZEWANIA) przez 2-3 minuty.
• Po 2-3 minutach mieszania odstawić płytkę (bez mieszania) na 5 minut, aby umożliwić nierozpuszczalnemu materiałowi osadzenie się z roztworu na dnie fiolek.
• Podczas gdy płytka odpoczywa, dodaj 700 µl acetonitrylu do każdej z 24 indywidualnie oznakowanych (A1, A2 itd.) fiolek HPLC lub do każdej z 24 studzienek 96-dołkowego bloku automatycznego próbnika HPLC/UPLC (patrz "dodatkowe zalecane materiały" poniżej, aby uzyskać sugestie dotyczące bloku automatycznego próbnika i maty nasadkowej).
• Ostrożnie zdejmij pokrywę z KitAlysis 24-dołkowego bloku reakcyjnego.
• Używając czystej pipety za każdym razem, pobierz porcję 25 µL z każdej fiolki do odpowiednich fiolek HPLC lub bloku HPLC . Uważaj, aby pobrać materiał z górnej części fiolek, aby uniknąć wytrącenia się osadu.  
  
• Uruchom na automatycznym próbniku HPLC. Może być konieczne dostosowanie ilości acetonitrylu z sugerowanych 700 µL, aby dostosować go do unikalnego systemu HPLC.

Dodatkowe wskazówki

Uszczelnianie płytki - przykręcanie pokrywy

Prawidłowe uszczelnienie płytki ma kluczowe znaczenie dla sukcesu. Kluczem jest lekki, równomierny nacisk na pokrywę bloku, aby utrzymać pokrywę płasko podczas uszczelniania.

1. Dokręć śruby, upewniając się, że otwory sondy temperatury w podstawie i pokrywie są wyrównane w 24-dołkowym bloku reakcyjnym KitAlysis.
2. Wstępne płukanie: Używając kciuka i palca wskazującego, naciśnij pokrywę pudełka, aż zrówna się z fiolkami. Następnie, używając śrubokręta dynamometrycznego KitAlysis Torque Screwdriver, włóż śruby, aż zrównają się, ale nie dokręcą, z górną częścią pudełka, zgodnie ze wzorem krzyża podanym poniżej. Sprawdź, czy pokrywa jest równomiernie uszczelniona na podstawie ze wszystkich stron. Wykonaj tę wizualną kontrolę, aby uniknąć konieczności odkręcania pokrywy i ponownego wkręcania śrub.
3. Dokręcanie: Powtarzaj ten sam schemat, aż KitAlysis Torque Screwdriver "kliknie", wskazując całkowite dokręcenie. Obejdź blok jeszcze raz, aby upewnić się, że wszystkie śruby są dokręcone.

Rysunek 2. Wzór śrub dla 24-dołkowych płytek reakcyjnych

Sonda do płyty grzejnej nie mieści się w otworze bloku reakcyjnego

Użyj małej łaźni olejowej lub innego metalowego bloku (aby uzyskać najlepsze wyniki) z tyłu płyty grzejnej i umieść tam sondę. Umieść blok reakcyjny jak najbliżej środka płyty grzejnej, aby uzyskać bardziej równomierne mieszanie.

Dodawanie zawiesiny

Z powodu wąskiego otworu końcówek pipety, dodawanie zawiesiny spowoduje zablokowanie. Aby pomóc w równomiernym dozowaniu, wystarczy odciąć koniec końcówki przy pierwszym znaczniku (~10 mm). Aby zapewnić równomierne rozproszenie porcji, bardzo ważne jest, aby mieszanina była dobrze mieszana podczas pobierania porcji do dozowania do odpowiedniej fiolki reakcyjnej.

Rysunek 3. Odetnij około 10 mm od końca pipety